酸性多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究發(fā)展趨勢*

雷曦，邸晶蕊，付志飛，楊妙婕，王澤玲，張鵬

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

酸性多糖是指含有羧基或硫酸根等酸性基團(tuán)的多糖，是一種重要的生命物質(zhì)。其來源廣泛，具有多種生物活性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖和抗腫瘤等活性，且其毒副作用小，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ呀?jīng)受到越來越多的關(guān)注和研究。酸性多糖屬于高分子化合物，一般有較多分支，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易分離鑒定，給其研究和臨床應(yīng)用帶來了很大的限制。文章對目前關(guān)于酸性多糖生物活性及結(jié)構(gòu)解析的研究進(jìn)行比較和總結(jié)，為未來酸性多糖的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 酸性多糖的來源

酸性多糖主要來源于植物、動物和微生物。植物來源的酸性多糖主要從植物的根、莖、葉及果實中提取分離得到。動物來源的酸性多糖如肝素主要從動物組織中提取出來，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的酸性多糖，具有抗凝血活性[1]。微生物中的酸性多糖主要來源于胞外多糖、胞內(nèi)多糖和細(xì)胞壁多糖，與動植物來源的酸性多糖相比，微生物來源的酸性多糖更為多樣和復(fù)雜。

2 酸性多糖的提取、分離純化

酸性多糖的提取方式包括水提取法、堿水提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法和酶輔助提取法等，通過這些方法提取得到通常為粗多糖，粗多糖通常采用沉淀法和柱層析法進(jìn)行分離純化。沉淀法包括分級醇沉法和季銨鹽沉淀法等[2]。常用的柱層析填料包括離子交換類的二乙氨基乙基（DEAE）-葡聚糖、DEAE-纖維素和DEAE-瓊脂糖，以及凝膠類填料葡聚糖凝膠（Sephadex G）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）等。采用單一的分離純化方法往往達(dá)不到純化酸性多糖的目的，目前研究多聯(lián)合采用多種方法對酸性多糖進(jìn)行分離。Ma等[3]采用熱水提取、乙醇沉淀、DEAE-52和Sephadex G-100柱層析從銀條中分離出酸性多糖SFPSA。Zhu等[4]采用超聲輔助提取后，經(jīng)DEAE-52和Sepharose CL-4B柱層析從何首烏中分離出酸性多糖APS。

3 酸性多糖的結(jié)構(gòu)解析

作為高分子化合物，酸性多糖的結(jié)構(gòu)可分為一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)屬于初級結(jié)構(gòu)，二級、三級和四級結(jié)構(gòu)屬于高級結(jié)構(gòu)。由于酸性多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，往往需要同時結(jié)合多種方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

3.1 酸性多糖初級結(jié)構(gòu)研究方法 酸性多糖初級結(jié)構(gòu)研究包括：相對分子量、單糖組成、糖構(gòu)型、糖苷鍵種類以及糖殘基間的連接方式的鑒定。測定酸性多糖相對分子質(zhì)量的方法主要有黏度法、超離心法、光散射法、滲透壓法以及高效凝膠色譜法等，其中高效凝膠色譜法（HPGPC）是目前最常用的鑒定純度和檢測分子量的方法。酸性多糖的單糖組成通常采用酸水解或衍生化-酸水解，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）或氣相色譜（GC）進(jìn)行分析來確定。酸水解常用三氟乙酸、硫酸以及鹽酸等強(qiáng)酸進(jìn)行水解；常用的衍生化法有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化法、三甲基硅醚衍生化法[5]、糖醇乙酸酯衍生物[6]等。

糖構(gòu)型、糖苷鍵類型及糖殘基連接方式主要通過甲基化反應(yīng)、高碘酸氧化-Smith降解、紅外光譜（FT-IR）以及核磁共振（NMR）來判斷。甲基化反應(yīng)是確定酸性多糖中各單糖殘基連接位點以及在多糖分子中所占比例的重要方法，但酸性多糖中存在大量糖醛酸，不易氣化水解，因此在酸性多糖進(jìn)行甲基化之前要先對糖醛酸進(jìn)行還原。高碘酸氧化-Smith降解反應(yīng)可以判斷酸性多糖分子中糖苷鍵的類型和位置[7]。通常采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）分析甲基化產(chǎn)物和高碘酸氧化-Smith降解產(chǎn)物，確定酸性多糖的單糖組成、糖苷鍵的類型以及連接方式[8]。FT-IR常用來判斷酸性多糖的構(gòu)型及糖苷鍵的類型。核磁共振（NMR）法是解析酸性多糖結(jié)構(gòu)最重要的分析手段之一。根據(jù)1D NMR中的端基氫和端基碳信號可以確定酸性多糖結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵構(gòu)型、糖殘基類型和比例，糖殘基的連接方式需要通過2D NMR來確定。

Sahragard等[9]研究覆盆子酸性多糖結(jié)構(gòu)，通過HPGPC法測得酸性多糖RAPS-1的分子量為7kDa；通過糖醇乙酸酯衍生化法結(jié)合GC測得RAPS-1由葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcA）組成；通過高碘酸氧化-Smith降解確定RAPS-1中單糖可能存在的連接形式；通過FT-IR分析得出RAPS-1中存在α-吡喃糖；通過甲基化反應(yīng)確定RAPS-1中糖殘基的具體構(gòu)型；通過NMR分析得到RAPS-1的糖鏈?zhǔn)且?，4-linked Glcp為主鏈，支鏈連接在主鏈Glcp的6位。Zhou等[10]研究枸杞酸性多糖結(jié)構(gòu)時，采用HPGPC法測得酸性多糖LBP1B-S-2的分子量為131.78 kDa，采用PMP衍生化法結(jié)合HPLC測得LBP1B-S-2由鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、Gal和GluA組成；利用甲基化反應(yīng)確定LBP1B-S-2中糖殘基具體構(gòu)型；通過NMR分析得到 LBP1B-S-2糖鏈?zhǔn)且?1，3-linkedGalp與 1，6-linkedGalp為主鏈，支鏈連接在主鏈的 1，6-linkedGalp的3位或1，3-linkedGalp的6位。

3.2 酸性多糖高級結(jié)構(gòu)研究方法 酸性多糖的生物活性與高級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，但目前有關(guān)酸性多糖的高級結(jié)構(gòu)的分析方法還比較少。剛果紅（Congo red）試驗是用于測定酸性多糖中的三螺旋結(jié)構(gòu)，原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)主要用于觀察酸性多糖的分子形態(tài)以及對酸性多糖分子的高度、輪廓長度、末端距和持續(xù)長度進(jìn)行測量[11]，掃描電鏡（SEM）技術(shù)用來分析酸性多糖樣品表面或斷口形貌，X射線衍射技術(shù)（XRD）用來分析酸性多糖的立體化學(xué)信息，如鍵長、鍵角和構(gòu)型等信息，以確定多糖的立體構(gòu)型[12]。

Wang等[13]在研究大棗酸性多糖高級結(jié)構(gòu)時，通過FT-IR和AFM分析，確定酸性多糖LZJP3和LZJP4是具有大量分子球狀聚集體的β-吡喃多糖，通過SEM分析，其表面形貌為棒狀集合體，呈光滑、絲狀交錯擴(kuò)展。Ma等[14]研究山藥酸性多糖高級結(jié)構(gòu)時，通過SEM和XRD分析，表明酸性多糖DOMP具有球形鱗片狀結(jié)構(gòu)。Lin等[15]研究涼粉草酸性多糖的結(jié)構(gòu)特征，通過SEM分析表明，酸性多糖MCP具有獨(dú)特的荷葉狀形貌，表面有不規(guī)則的小圓形棒狀物。

4 酸性多糖的生物活性

酸性多糖具有多種生物活性，包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等，本文總結(jié)了近年來報道的酸性多糖來源、結(jié)構(gòu)表征及生物活性，見表1。

表1 酸性多糖的生物活性及結(jié)構(gòu)鑒定

4.1 抗氧化活性 當(dāng)機(jī)體存在大量的自由基時，會造成機(jī)體的各種損傷，加速機(jī)體衰老并誘發(fā)各種疾病，目前研究表明，酸性多糖具有一定的抗氧化能力。Zhai等[25]研究石榴皮中酸性多糖的體外抗氧化活性，酸性多糖PPP對超氧陰離子、羥基和DPPH自由基有顯著的清除作用。Zhang等[26]研究忍冬中酸性多糖的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)酸性多糖LJP-a-3和LJP-a-4能清除DPPH、ABTS+、氫氧自由基和超氧自由基，對雙氧水（H2O2）誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血和氧化損傷DNA具有保護(hù)性。

4.2 免疫調(diào)節(jié)活性 免疫調(diào)節(jié)是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵，對于預(yù)防和治療感染、炎癥和癌癥等疾病有著重要意義。已有研究表明酸性多糖能通過多種途徑來實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，如激活并提高吞噬細(xì)胞的吞噬功能及促進(jìn)分泌細(xì)胞因子等。Sun等[27]在研究山芝麻酸性多糖的免疫調(diào)節(jié)活性中，發(fā)現(xiàn)酸性多糖SPF3-1能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，刺激巨噬細(xì)胞的吞噬能力，誘導(dǎo)一氧化碳（NO）和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Hsu等[28]在研究金黃銀耳酸性多糖的抗免疫活性中，發(fā)現(xiàn)酸性多糖GX能顯著增加人外周血和脾T淋巴細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生，以及顯著減少脾臟淋巴細(xì)胞中TNF-γ的產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)免疫作用。

4.3 降血糖 治療糖尿病的藥物主要為雙胍類和磺酰脲類，但這些藥物毒副作用大，且有可能產(chǎn)生機(jī)體依賴性[29]。研究表明某些酸性多糖具有降糖作用，Zhang等[30]研究油茶中酸性多糖的降血糖作用，發(fā)現(xiàn)酸性多糖CCP能促進(jìn)HepG2細(xì)胞消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖，其消耗率顯著高于相同濃度下鹽酸二甲雙胍和油茶粗多糖的相對消耗率，表明CCP具有降糖作用。Liu等[31]研究草珊瑚酸性多糖對Ⅱ型糖尿病小鼠的降血糖作用，發(fā)現(xiàn)酸性多糖SERP1能降低糖尿病小鼠的血糖，增加肝臟外周組織對葡萄糖的利用；體外α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）抑制試驗表明，SERP1對α-glucosidase酶的抑制活性強(qiáng)于阿卡波糖。

4.4 降血脂 控制和降低血脂可減少動脈粥樣硬化、冠心病、血栓等心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險[32-33]。酸性多糖具有降血脂的功能。Lee等[34]研究天麻酸性多糖對高血脂大鼠的降血脂作用，發(fā)現(xiàn)酸性多糖能顯著降低高血脂大鼠的三酰甘油、低密度脂蛋白水平以及總膽固醇含量，對動脈粥樣硬化有明顯的抑制作用。

4.5 抗腫瘤 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的健康，抗腫瘤藥物研發(fā)歷來被人們所重視，酸性多糖具有抗腫瘤活性。Mahgoub等[35]研究海洋桿菌MHM3中酸性多糖的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)酸性多糖MHMEPS在低濃度下能阻礙人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，并通過激活caspase-3誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。Zhang等[36]研究草珊瑚酸性多糖的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)酸性多糖SGP-2能顯著抑制MG-63人骨肉瘤細(xì)胞的增殖，可通過激活Caspase-3誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞的凋亡，并抑制MG-63骨肉瘤細(xì)胞的遷移。

4.6 抗炎活性 很多疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著炎癥反應(yīng)，酸性多糖具有抗炎活性。Shi Wenting等[37]研究益智酸性多糖AOP70-2-1的抗炎活性，結(jié)果顯示其可顯著抑制脂多糖刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中NO的生成，顯著降低IL-6和TNF-α的分泌。袁雷等[38]研究血滿草中酸性多糖的抗炎活性，顯示酸性多糖SPS-1及其衍生物SPSS-1可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎性因子 IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，同時可顯著增加抗炎因子IL-10的分泌。

4.7 抗菌活性 細(xì)菌引起的感染不僅加大了治療難度，而且容易引起較高的致病率和致死率。近年來研究表明，酸性多糖能抑制多種臨床常見細(xì)菌的生長。Reyes等[39]研究紅參酸性多糖的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)酸性多糖RGAP在巨噬細(xì)胞內(nèi)可以抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號蛋白ERK、JNK和p38的表達(dá)，從而干擾布魯氏菌的吞噬活性，并通過增強(qiáng)噬菌體融合來抑制布魯氏菌的胞內(nèi)復(fù)制，從而起到抗菌作用。

4.8 抗病毒活性 近年來研究表明，酸性多糖具有抗病毒活性，其抗病毒機(jī)制一般被認(rèn)為是酸性多糖可以抑制病毒早期階段的復(fù)制。Mikinori Ueno等[40]研究海藻酸性多糖的抗病毒活性，發(fā)現(xiàn)兩種巖藻多糖能抑制HIV-1病毒在TZM-bl和MT-4細(xì)胞中的早期感染，且能抑制HBV病毒在HepG2.2.15.7細(xì)胞中的早期感染，表明兩種酸性多糖具有抗病毒活性。

4.9 其他活性 除上述活性之外，酸性多糖還有抗衰老、抗輻射、保肝等生物活性。Zhang等[41]研究姬松茸中酸性多糖對雄性小鼠的抗衰老作用，發(fā)現(xiàn)酸性多糖MZPS可增加雄性小鼠體內(nèi)的總抗氧化能力（T-AOC）、GSH過氧化物（GSH-px）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量，降低丙二醛（MDA）的含量，具有抗衰老作用。Bing等[42]研究人參酸性多糖對小鼠的抗輻射作用，發(fā)現(xiàn)酸性多糖APG顯著降低輻射誘導(dǎo)的小鼠空腸細(xì)胞的凋亡，提高抗凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-XS/L）的表達(dá)水平，顯著降低促凋亡蛋白（p53、BAX、細(xì)胞色素c和caspase-3）的表達(dá)水平，減少輻射誘導(dǎo)的肝腸損傷。Yuan等[43]研究五味子酸性多糖對乙醇致小鼠肝損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)酸性多糖SCAP可顯著降低乙醇模型組小鼠血清和HepG2細(xì)胞中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和丙二醛的水平，提高SOD活性，明顯緩解肝組織的病變，具有保肝作用。

5 結(jié)語與展望

文章綜述了近年來酸性多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性的研究進(jìn)展。根據(jù)上述文獻(xiàn)，目前已經(jīng)鑒定結(jié)構(gòu)的酸性多糖最大分子量為2 280 kDa，半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸為酸性多糖的主要酸性部分；由于糖醛酸的存在，酸性多糖較中性多糖不易被水解和氣化，增加了GC-MS對酸性多糖甲基化產(chǎn)物分析的難度，基于此研究者開發(fā)了糖醛酸還原方法，完善了甲基化方法在酸性多糖結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用。目前，酸性多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究主要集中在一級結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，僅有少量研究涉及了高級結(jié)構(gòu)，現(xiàn)有方法仍不能完全確定糖鏈的結(jié)構(gòu)，限制了酸性多糖結(jié)構(gòu)鑒定的研究。

酸性多糖具有多種生物活性，研究者通過體內(nèi)外實驗證明了酸性多糖具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和降血脂等活性并研究了其作用機(jī)制，但由于酸性多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、不規(guī)律性，使得酸性多糖分子結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系仍然不明確，嚴(yán)重阻礙了酸性多糖的深入研究，這也是大多數(shù)酸性多糖只停留在藥理實驗中，缺乏廣泛臨床應(yīng)用的主要原因。

因此，未來的研究應(yīng)繼續(xù)對酸性多糖的分離純化方法進(jìn)行優(yōu)化，通過研究酸性多糖的寡糖片段和高級結(jié)構(gòu)表征酸性多糖的精確結(jié)構(gòu)，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及各種組學(xué)技術(shù)，深入研究酸性多糖作用的有效靶點及其作用機(jī)制，為明確酸性多糖的構(gòu)效關(guān)系以及開拓酸性多糖的應(yīng)用提供理論支持。