10個產(chǎn)地不同生態(tài)型種質(zhì)薄荷引種于天津地區(qū)的培育研究*

安娜娜 ，姜琳 ，李希凡 ，馮建明 ，王蘭芳 ，李天祥

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊天津康復(fù)療養(yǎng)中心，天津 300381）

薄荷為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分。味辛，涼，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，清利頭目，解郁，利咽，透疹，疏肝行氣的療效[1]，是臨床常用的大宗中藥之一。同時，也廣泛應(yīng)用于食品，工業(yè)等領(lǐng)域。

薄荷對不同生長環(huán)境適應(yīng)性強，分布區(qū)域較廣。目前薄荷的主要產(chǎn)區(qū)有江蘇、河南、河北等地。薄荷無性繁殖和雜交現(xiàn)象普遍，品種（生態(tài)型）繁多，不同品種和不同產(chǎn)地外部形態(tài)和化學(xué)成分含量變化較大。同時，隨著人工培植的推廣，出現(xiàn)了大量薄荷品種混雜、退化的嚴(yán)重現(xiàn)象[2-3]。近年來，隨著對薄荷育種研究不斷深入，對于薄荷的資源評價已經(jīng)從單一方面評價轉(zhuǎn)為綜合評價，不但重視薄荷資源經(jīng)濟性狀的優(yōu)劣，同時也更加關(guān)注遺傳多樣性、藥效成分差異等方面的系統(tǒng)綜合評價。薄荷為沼生濕性植物，天津位于海濱，土壤濕潤，適合薄荷的生長。于2017年開始引種薄荷于天津，并相繼考察不同居群引種于天津薄荷外觀性狀差異，擬揭示不同薄荷種質(zhì)資源的藥效活性成分變化規(guī)律，最終篩選優(yōu)良薄荷品種，以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥材。研究通過考察引種于天津不同種質(zhì)薄荷的外觀性狀特征，闡明不同產(chǎn)地薄荷的外觀形態(tài)差異特征，基于薄荷在藥典指標(biāo)成分、其他重要藥效成分及生物量為質(zhì)量考察指標(biāo)，對不同產(chǎn)地來源品種引種后的藥材品質(zhì)進行系統(tǒng)質(zhì)量評價，確定優(yōu)良品種，為進一步開展薄荷選種育種和在天津規(guī)模推廣種植奠定科學(xué)的基礎(chǔ)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（配置B05型高壓梯度泵，UV 1000型全波段可編程紫外可見檢測器，CSChrom Plus色譜工作站，美國Alltech科技有限公司）、YHG-600-BS-Ⅱ型遠紅外快速干燥箱（上海賀德實驗設(shè)備有限公司）、UV-6100型紫外可見分光光度計（上海美普達有限公司）、調(diào)溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠）、FA 2104電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）、十萬分之一天平（BT25S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、SB25-12DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、移液槍（賽默飛世爾科技有限公司）、揮發(fā)油提取器。

1.2 試劑 蘆丁對照品（北京索萊寶科技有限公司，NO1009H022）、咖啡酸對照品（北京索萊寶科技有限公司，NO806D025）、迷迭香酸對照品（北京索萊寶科技有限公司，NO228B022）、甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）、甲醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）、乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）、磷酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、95%乙醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）、硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）、氫氧化鈉（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）、亞硝酸鈉（分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司）、娃哈哈純凈水（天津娃哈哈食品有限公司）。

1.3 引種種源和材料 收集自中國主產(chǎn)區(qū)江蘇鹽城、江蘇南京、廣東廣州、河南焦作等10個不同地區(qū)的栽培生態(tài)型薄荷，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定，為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的根莖，留種于天津中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)資源圃，2019年春季統(tǒng)一種植。樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地薄荷種質(zhì)信息

1.4 引種地概況 本實驗地點位于天津市靜海區(qū)天津中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)資源圃，位處暖溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年降水量500～700 mm，年日照時數(shù)2 610～3 090 h，年均溫12℃左右[4]，實驗田土壤類型為鹽化潮土。土壤基本理化性狀為pH 5.57，有機質(zhì) 6.01 g/kg，全氮 0.90 g/kg，全磷 0.089 g/kg，全鉀20.00 g/kg，銨態(tài)氮 46.40 mg/kg，速效磷 8.10 mg/kg，速效鉀56.10 mg/kg。

2 方法

2.1 引種種植方法 采用薄荷根莖進行繁殖，按照行距25～30 cm，株距10 cm移栽，溝深8 cm，橫向開溝，將留種的薄荷根莖挖起，選擇粗壯、色白、節(jié)間較短的新根莖，切成7～10 cm左右的小段作為繁殖材料，平擺于溝內(nèi)，蓋土，踩實，澆水。采用隨機區(qū)組設(shè)計進行實驗，以減小實驗外部條件的影響，每個品種各設(shè)置3個試驗小區(qū)，隨機排列，不同品種之間間隔50 cm，所有品種于2019年5月8日栽植完成。

2.2 外觀形狀及生物量的測定 采用多點隨機混合取樣，每個小區(qū)分別選取長勢一致的薄荷樣品，每個產(chǎn)地的薄荷引種天津后于采收期內(nèi)各隨機抽取10株樣品，株高、分支用鋼卷尺進行測量，葉柄長度用游標(biāo)卡尺測量，分別稱重，結(jié)果取算數(shù)平均值。采集的樣品在同一條件下陰干，裝入封口袋中密封冷藏、備用。

2.3 揮發(fā)油含量測定 取不同品種薄荷藥材樣品，分別精密稱取過3號篩（50目）的薄荷粉末40 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，少量碎瓷片，搖勻，按照2020版《中華人民共和國藥典》揮發(fā)油測定法（通則2204揮發(fā)油測定法甲法）提取揮發(fā)油，控制溫度使之微沸3 h，停止加熱，冷卻至室溫，待其分層后，保持視線與凹液面最低點平齊，讀取揮發(fā)油測定器讀數(shù)并收集所得揮發(fā)油，加入少量無水硫酸鈉，靜置。每個產(chǎn)地平行操作3次，計算平均得油率。

2.4 總黃酮含量測定

2.4.1 對照品儲備液的制備 將蘆丁對照品干燥至恒重，精密稱取5.0 mg，用濃度30%的乙醇溶解于25 mL的容量瓶中，即得濃度0.2 mg/mL的對照品儲備液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取過3號篩（50目）的薄荷粉末1 g，置于250 mL的錐形瓶中，加入30 mL 40%乙醇溶液，50℃水浴1 h，然后超聲提取 40 min（功率 500 W、頻率 40 kHz），冷卻后，過濾。濾液用30%乙醇定容至100 mL，搖勻。

2.4.3 顯色及測定方法 取供試品溶液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇2 mL，5%NaNO20.3 mL，搖勻，避光靜置5 min，加入10%Al（NO3）30.3 mL，避光靜置 5 min，加入 4%NaOH 2 mL，搖勻使其完全反應(yīng)，用30%乙醇溶液定容至刻度線，避光靜置15 min，即得。以顯色劑為空白，于510 nm波長處測定吸光值。

2.5 有機酸類成分含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 咖啡酸：精密稱定咖啡酸對照品4.3 mg，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得濃度為0.43 mg/mL咖啡酸對照品儲備液，精密移取咖啡酸對照品儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，定容，即得濃度為43 μg/mL的咖啡酸對照品溶液。迷迭香酸：精密稱定迷迭香酸對照品6.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得濃度為0.6 mg/mL迷迭香酸對照品儲備液。

2.5.2 供試品溶液的制備 咖啡酸：精密稱取薄荷樣品粉末1 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，冷卻至室溫后稱質(zhì)量，用50%甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，置50 mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液。迷迭香酸：精密稱取薄荷樣品粉末1 g，置于150mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，冷卻至室溫后稱質(zhì)量，用50%甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，置50 mL容量瓶中，定容，從中精密移取1 mL，置10 mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液。

2.5.3 色譜條件 咖啡酸：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；等度洗脫 11%（A）～89%（B）；流速0.8 mL/min；檢測波長321 nm；柱溫25℃。迷迭香酸：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）～0.1%磷酸水（B）；等度洗脫20%（A）-80%（B）；流速 1 mL/min；檢測波長 330 nm；柱溫30℃。見圖1。

圖1 對照品（A、B）和薄荷樣品（C、D）HPLC色譜圖

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取各對照品儲備液適量，按相應(yīng)方法制成系列濃度的對照品溶液，按“2.4.3”項下方法測定吸光度、“2.5.3”項下方法測定峰面積，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度或峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察

2.6.2 重復(fù)性考察 依據(jù)上述供試品溶液制備方法分別取同一樣品各制備6份，按“2.4.3”“2.5.3”項下方法進行測定，計算得到總黃酮吸光度的RSD為0.73%，咖啡酸、迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.71%、2.59%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.3 精密度實驗 取各對照品溶液，按“2.4.3”“2.5.3”項下方法分別連續(xù)進樣測定6次，計算得到總黃酮吸光度的RSD為0.02%，咖啡酸、迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.34%、1.20%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實驗 取各薄荷供試品溶液，每隔10 min在510 nm波長下測定吸光度，連續(xù)在1 h測定其穩(wěn)定性，計算得到總黃酮吸光度為RSD=1.14%；分別于 1、2、4、8、10 和 12 h 進樣測定峰面積，得咖啡酸峰面積 RSD=2.83%；分別于 0、2、4、8、12 和 24 h 進樣測定峰面積，得迷迭香酸峰面積RSD=2.57%，表明各供試品溶液在相應(yīng)的檢測時間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率考察 精密稱取已知成分含量的各薄荷供試品，分別加入對照品儲備液適量，按“2.4.3”“2.5.3”項下方法分別連續(xù)測定6次，計算加樣回收率結(jié)果蘆丁的平均回收率為100.80%，RSD為1.90%，咖啡酸的平均回收率為99.60%，RSD=2.40%，迷迭香酸的平均回收率為102.26%，RSD=2.72%，表明本試驗方法穩(wěn)定可行。

2.7 樣品含量測定 采用SPSS 23.0軟件分析統(tǒng)計，計量資料符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Waller-Duncan檢驗。檢驗水平α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 引種薄荷的形態(tài)指標(biāo) 天津引種薄荷主要外觀性狀如表3所示。10種不同產(chǎn)地薄荷在春季引種至天津后，外部形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，尤其是莖的顏色區(qū)別較大。在同等栽培密度條件下，各產(chǎn)地薄荷株高差異較大，其中河北安國為80.42 cm，遠高于其他產(chǎn)地，且具有顯著性差異（P<0.05）。河北鹿泉、河北安國、河北秦皇島和吉林長春樣品莖色呈紫色，其他莖色均為青綠色。品種間莖節(jié)數(shù)變化范圍為12.75～25.33個，江蘇鹽城顯著高于其他品種。品種間分枝數(shù)變化范圍為15.91～32.33個，河北安國顯著高于其他地區(qū)。品種間分枝長變化范圍為9.45～63.9 cm，河北安國顯著高于其他品種（P<0.05）。葉柄長度以吉林長春最高為1.46 cm，顯著高于其他產(chǎn)地樣品（P<0.05）。

表3 10個栽培品種薄荷數(shù)量多態(tài)性狀（±s）

表3 10個栽培品種薄荷數(shù)量多態(tài)性狀（±s）

注：同一列沒有相同英文字母者，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；有相同英文字母者，則表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

編號 株高（cm） 莖節(jié)數(shù)（個） 分枝數(shù)（個） 分支長（cm） 葉柄長（cm）廣東廣州 38.60±10.61cd 19.00±2.83c 24.00±1.41abcd 35.80± 5.94bc 1.08±0.25ab江蘇鹽城 56.40± 8.89b 25.33±2.24a 29.67±3.32ab 45.88±13.08ab 0.72±0.34bcd江蘇南京 43.56± 3.69bc 21.30±2.58abc 27.00±4.32abc 34.29±12.94bcd 0.48±0.23cd河南焦作 39.25± 7.10c 16.73±3.64cd 15.91±2.84d 20.12± 8.46cde 0.77±0.19bcd河南信陽 38.70±10.75cd 20.30±2.41bc 21.20±2.62bcd 25.25±11.04cde 0.93±0.24bc河北平山 42.82± 6.35bc 21.40±2.80abc 26.90±7.03abc 36.86± 5.36bc 0.41±0.08d河北鹿泉 28.08± 6.48cd 13.75±2.06d 17.25±1.89d 9.45± 3.61e 0.81±0.03bcd河北安國 80.42±12.28a 24.50±2.66ab 32.33±9.46a 63.95±18.19a 0.79±0.22bcd河北秦皇島 43.63± 3.35bc 21.33±1.53abc 19.00±5.00cd 15.33± 3.00de 0.63±0.29bcd吉林長春 23.13± 1.02d 12.75±1.26d 16.75±0.96d 10.78± 2.41e 1.46±0.30a n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10莖色青綠色青綠色青綠色青綠色青綠色青綠色紫色紫色紫色紫色

3.2 引種薄荷的生物量測定 由表4可知，各產(chǎn)地薄荷引種天津后生物量差異較大（P<0.05），其中河北安國，江蘇鹽城薄荷生物量較大，與“3.1”中薄荷形狀分析結(jié)果基本一致，表明植株株高、分枝數(shù)、分支長等性狀與生物量存在一定的正相關(guān)，分支較多，莖葉繁茂的薄荷生物量相對較大，植株外部性狀指標(biāo)可以為考察其生物量及產(chǎn)量、篩選優(yōu)質(zhì)品種提供一定的依據(jù)。

表4 不同產(chǎn)地薄荷引種天津生物量測定結(jié)果（±s）

表4 不同產(chǎn)地薄荷引種天津生物量測定結(jié)果（±s）

注：同一列沒有相同英文字母者，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；有相同英文字母者，則表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

產(chǎn)地 n 生物量（g）廣東廣州 10 82.86±18.50bc江蘇鹽城 10 88.86±22.13b江蘇南京 10 52.82±24.29cd河南焦作 10 59.79±25.71c河南信陽 10 78.35±28.89bc河北平山 10 75.40±22.21bc河北鹿泉 10 31.70±10.22d河北安國 10 142.76±32.75a河北秦皇島 10 24.61± 8.41d吉林長春 10 30.66±11.36d

3.3 引種薄荷中主要功效成分的含量測定 如表5所示，基于藥典指標(biāo)成分揮發(fā)油，各品種之間含量差異較大（P<0.05）。江蘇鹽城和河南信陽樣品含量最高，均為2.54%，各個產(chǎn)地品種于0.80%～2.54%，最高者是最低者3倍以上，藥材質(zhì)量參差不齊，但各引種品種藥材的指標(biāo)成分均滿足藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)（0.80%），說明薄荷引種天津后，生態(tài)適應(yīng)性良好，藥效物質(zhì)積累較為豐富，具有規(guī)模引種的可能性。基于薄荷總黃酮含量，各產(chǎn)地于96.36～168.21 mg/g，最高者為河北安國及江蘇鹽城薄荷，分別為168.21 mg/g、165.68mg/g，且與其他產(chǎn)地相比存在顯著性差異，兩地薄荷藥效成分總黃酮的含量較豐富，表明此兩種薄荷在發(fā)揮祛痰、抗氧化和鎮(zhèn)痛的功效方面具備一定優(yōu)勢?；谟袡C酸類成分，各產(chǎn)地咖啡酸含量于0.09～0.53 mg/g，各品種含量差異較大，最高者為江蘇鹽城薄荷，咖啡酸含量為0.53 mg/g，與其他產(chǎn)地相比存在顯著性差異；各產(chǎn)地迷迭香酸含量于1.01～13.59 mg/g，最高者是最低者的10倍以上，各品種含量差異較大，其中河北安國的薄荷品種迷迭香酸含量較高，迷迭香酸含量為13.58 mg/g，與其他產(chǎn)地相比存在顯著性差異。

表5 不同產(chǎn)地薄荷引種天津藥效組分含量測定結(jié)果（±s）

表5 不同產(chǎn)地薄荷引種天津藥效組分含量測定結(jié)果（±s）

注：同一列沒有相同英文字母者，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；有相同英文字母者，則表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

迷迭香酸（mg/g）廣東廣州 3 1.00±0.00bc 115.03±1.38bd 0.16±0.03d 1.34±0.23e江蘇鹽城 3 2.54±0.19a 165.68±4.50a 0.53±0.02a 6.86±0.24b江蘇南京 3 0.83±0.00c 128.08±4.08b 0.39±0.02b 4.14±0.06c河南焦作 3 2.21±0.07a 99.59±4.49cd 0.10±0.01ef 4.11±0.05c河南信陽 3 2.54±0.26a 99.63±1.02c 0.12±0.01e 2.44±0.17d河北平山 3 1.19±0.09bc 100.21±0.79c 0.09±0.01f 4.14±0.08c河北鹿泉 3 0.80±0.00c 96.36±2.22c 0.16±0.02d 2.31±0.30e河北安國 3 1.81±0.27abc 168.21±7.70a 0.10±0.01ef 13.58±0.02a河北秦皇島 3 0.87±0.01c 116.49±2.64bd 0.22±0.01c 7.53±1.07b吉林長春 3 1.32±0.00b 101.35±2.22c 0.09±0.02f 1.01±0.24e產(chǎn)地 n 揮發(fā)油（%）總黃酮（mg/g）咖啡酸（mg/g）

4 討論

實驗開展了來自10個不同產(chǎn)地的薄荷品種在天津引種大田實踐。實驗結(jié)果顯示，從外觀性狀分析數(shù)據(jù)來看，河北安國、江蘇鹽城2個產(chǎn)地的品種分支較多，外部形態(tài)性狀較優(yōu)；從藥效成分含量分析，江蘇鹽城薄荷揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分含量均占據(jù)一定優(yōu)勢，河南信陽薄荷揮發(fā)油含量也較高。河北安國薄荷揮發(fā)油含量低于江蘇鹽城品種，但其總黃酮成分和有機酸類成分中的迷迭香酸含量豐富，河北秦皇島的薄荷品種迷迭香酸含量豐富。其中河北安國與天津位于同一緯度帶，同屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均溫、降雨量、日照時長等基本一致，這在一定程度上致使其種質(zhì)資源在天津地區(qū)生長適應(yīng)性良好，植株較高，莖稈粗壯，葉片繁茂。江蘇作為薄荷的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，在長期的栽培過程中，通過自然選擇或人工選育篩選出了產(chǎn)量較高、抗逆性好、生態(tài)適應(yīng)性強的優(yōu)質(zhì)品種資源，推測這是其在異地引種品質(zhì)仍較優(yōu)的重要原因。

薄荷屬于長日照植物，充足的光照可促進薄荷開花，有利于薄荷油、薄荷腦的積累，一般土壤均能栽培[5]。天津地處溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，夏季高溫干燥，氣候有利于薄荷揮發(fā)油的積累。試驗田土壤類型為鹽化潮土，鹽堿化程度較高，雖然存在泛堿、泛鹽的情況，但鹽堿粘粒土壤中毛細(xì)管作用在將鹽、堿輸送至土壤表層的同時，有效提高了土壤表層與底層的養(yǎng)分交換能力，使土壤肥力常新[6]，能滿足薄荷快速生長所需的豐富礦物質(zhì)元素。李玉梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)東北薄荷對混合鹽脅迫具有較強的耐受性，且低濃度混合鹽脅迫對東北薄荷種子萌發(fā)具有一定的促進作用，由此可見雖然薄荷本身為沼澤濕生植物，但其對黏重鹽漬化土質(zhì)有較強耐受，本實驗引種后也發(fā)現(xiàn)天津鹽漬化土壤較適合薄荷的生長，生物量較高。因此，基于薄荷適應(yīng)性強的生物特性和藥用價值高，在天津推廣種植薄荷具備一定可行性和經(jīng)濟價值。目前，在薄荷種質(zhì)研究上主要重視產(chǎn)油量較高的薄荷品種的收集和保存，卻忽略抗性資源的收集的情況。因此，在本實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)進一步擴大試驗面積，考察不同品種的抗逆性、抗病性，加強對野生資源的收集和研究。

5 結(jié)論

本研究收集的薄荷品種豐富，具有多樣性，有較大的挖掘和應(yīng)用價值，為薄荷選種育種提供了充足的材料。其中江蘇鹽城和河北安國的薄荷品種種質(zhì)優(yōu)良，藥效物質(zhì)含量豐富，揮發(fā)油含量遠遠滿足藥典要求，生物量較大，產(chǎn)量高，在天津鹽漬化土壤引種后生長適應(yīng)性強，經(jīng)濟性狀好，在天津推廣引種具備一定可行性。