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    替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備工藝研究

    2021-12-13 02:56:52徐艷艷鄭麗君張霞燕吳振波朱延焱王海翔田吉來
    藥學(xué)研究 2021年11期
    關(guān)鍵詞:效果圖環(huán)素藥量

    徐艷艷,鄭麗君,張霞燕,吳振波,朱延焱,王海翔,田吉來

    (1.麗水市中心醫(yī)院,浙江 麗水 323000;2.中國藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇 南京 211198;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    替加環(huán)素(tigecycline),化學(xué)名為((4S,4aS,5aR.12aS)-4,7-雙(二甲氨基)-9-[(叔丁基氨基)乙酰氨基]-3,10,12,12a-四羥基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氫并四苯-2-甲酰胺,是由美國惠氏公司研制的一種具有超廣譜抗菌活性的新型甘氨酰環(huán)素類抗生素[1-2],對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌具有廣泛抗菌活性,尤其對鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌等具有很好作用[3-4]。替加環(huán)素為橘黃色粉末狀物質(zhì),是一種水溶的弱酸性化合物,logP為1.677 40。替加環(huán)素不穩(wěn)定,其水溶液在空氣中易發(fā)生氧化降解和差向異構(gòu)化,加熱和攪拌會(huì)加速其反應(yīng)進(jìn)行,差向異構(gòu)化后的替加環(huán)素不再具有抗菌活性[5-6]。替加環(huán)素需要被保存在-60 ℃中。另外目前市面上替加環(huán)素以凍干粉針劑為主要?jiǎng)┬?,存在靶向性不?qiáng)、無法通過血腦屏障等缺點(diǎn),在治療顱內(nèi)感染時(shí)療效較差。

    提高藥物穩(wěn)定性一般有環(huán)糊精包埋、PEG分子修飾、平衡離子成鹽、藥物分子框架技術(shù)、做成其他載藥體系(如微囊、脂質(zhì)體、膠束等)等方法[1]。其中,脂質(zhì)體是在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種具有脂質(zhì)雙分子層的超微球形載體制劑。脂質(zhì)體可以將藥物包裹在內(nèi)水相或者脂層,防止藥物受外界環(huán)境影響而降解。除此之外,它還具有如下特點(diǎn):①通過修飾脂質(zhì)體表層可以達(dá)到靶向治療作用;②修飾后可以避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除,提高藥物利用度,減少藥物劑量,提高藥效、降低不良反應(yīng)等;③生物相容性良好,易于通過生物屏障(血腦屏障、肺部黏液屏障等);④抵抗對藥物的耐藥性等[2]。因此,為了提高替加環(huán)素的穩(wěn)定性,改善替加環(huán)素的生物利用度,本研究擬制備替加環(huán)素脂質(zhì)體,采用離心法進(jìn)行包封率測定,并采用響應(yīng)面法進(jìn)行制備工藝優(yōu)化。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器 ATX224型電子天平(株式會(huì)社島津制作所);RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸器(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);HH-42型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱(常州國華電器有限公司);PHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);LC-15C型高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理(中國)有限公司];TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);KH-100B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

    1.2 試藥 替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(含量99%,批號:291641,北京百靈威科技有限公司);大豆卵磷脂(食品級,江蘇源盛通生物工程有限公司);膽固醇(批號:20181128,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?;無水乙醇(分析純,上海泰坦科技股份有限公司);二氯甲烷(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

    2 方法

    2.1 替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備 精密稱取10 mg替加環(huán)素和適量的膽固醇和大豆磷脂于500 mL圓底燒瓶中,加入二氯甲烷溶解,置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)制得磷脂膜,加入pH為7.2的PBS緩沖液50 mL,水浴加熱30 min后超聲分散5 min,得到均一的黃色溶液,吸取適量溶液過0.45 μm水系微孔濾膜,得到替加環(huán)素脂質(zhì)體,在4 ℃冰箱中保存[9]。

    2.2 脂質(zhì)體中替加環(huán)素含量測定方法的建立

    2.2.1 色譜條件 色譜柱:UItimate XB-C18(4.5 mm×150 mm,3 μm),柱溫:室溫25 ℃,流動(dòng)相:PBS-EDTA緩沖液∶乙腈=75∶25,流速:1.0 mL·min-1,檢測波長:248 nm。

    2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5 mg替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品,用“2.2.1”項(xiàng)下流動(dòng)相配制成0.2 mg·mL-1替加環(huán)素儲(chǔ)備液,吸取一定量替加環(huán)素儲(chǔ)備液,以流動(dòng)相作為溶劑梯度稀釋獲得濃度為100、80、40、20、10 μg·mL-1對照品溶液。

    2.2.3 線性范圍考察 對照品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜柱條件進(jìn)行HPLC測定,以峰面積Y為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到方程為Y=50 526X-107 253,R2為0.999,線性范圍為10~100 μg·mL-1。

    2.3 建立替加環(huán)素脂質(zhì)體包封率測定方法 將制備好的替加環(huán)素脂質(zhì)體溶液高速離心(15 000 r·min-1、15 min),取上層清液,過0.22 μm的水系濾膜,用高效液相色譜儀檢測。按如下計(jì)算公式計(jì)算脂質(zhì)體包封率(EE)和載藥量,評價(jià)替加環(huán)素脂質(zhì)體的質(zhì)量,另設(shè)綜合評分指標(biāo)直觀評估替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備工藝。

    包封率(%)=(總替加環(huán)素-游離的替加環(huán)素)/總替加環(huán)素×100%

    載藥量(%)=(總替加環(huán)素-游離的替加環(huán)素)/磷脂用量×100%

    綜合評分(%)=包封率×50%+載藥量×50%

    3 結(jié)果

    3.1 單因素試驗(yàn) 固定二氯甲烷體積和大豆磷脂用量,對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備過程中的水化溫度、藥脂比、膽脂比這3個(gè)因素進(jìn)行單因素考察。以高速離心法聯(lián)合高效液相色譜法測定替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率。

    3.1.1 對水化溫度的考察 固定藥脂比為1∶20,膽脂比為1∶5,設(shè)置水化溫度分別是30、40、50、60、70 ℃,按上述方法制備替加環(huán)素脂質(zhì)體并測定其包封率及載藥量,如圖1所示。

    圖1 不同水化溫度對替加環(huán)素脂質(zhì)體品質(zhì)的影響

    結(jié)果顯示,其他參數(shù)條件不變時(shí),70 ℃水化溫度下制備的替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率和載藥量都最高,但在放置4 d后該試驗(yàn)所得的所有替加環(huán)素脂質(zhì)體受不同水化溫度影響而呈現(xiàn)不同程度的顏色變化,且越高的水化溫度其顏色變化越深??紤]到替加環(huán)素在高溫中不穩(wěn)定易變質(zhì),因此棄用70 ℃水化溫度,改用包封率、載藥量次之的60 ℃的水化溫度。

    3.1.2 對替加環(huán)素和總脂質(zhì)量比的考察 固定水化溫度為60 ℃,膽脂比為1∶5,設(shè)置藥脂比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,按上述方法制備替加環(huán)素脂質(zhì)體并測定其包封率及載藥量,如圖2所示。

    圖2 不同藥脂比對替加環(huán)素脂質(zhì)體品質(zhì)的影響

    結(jié)果顯示,隨著藥脂比的增大,包封率依次增大,而載藥量依次降低。而在綜合評分上,當(dāng)藥脂比為1∶30時(shí),數(shù)值最大。

    3.1.3 對膽固醇和大豆磷脂質(zhì)量比的考察 固定水化溫度為60 ℃,藥脂比為1∶20,設(shè)置膽脂比分別為1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8,按上述方法制備替加環(huán)素脂質(zhì)體并測定其包封率及載藥量,如圖3所示。

    圖3 不同膽脂比對替加環(huán)素脂質(zhì)體品質(zhì)的影響

    結(jié)果顯示,當(dāng)膽脂比是1∶6時(shí),替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率和綜合評分都達(dá)到了最高,而載藥量最高的膽脂比則是1∶5。綜合考慮,當(dāng)膽脂比為1∶6時(shí),制得的替加環(huán)素脂質(zhì)體的品質(zhì)最優(yōu)。

    3.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化處方 根據(jù)單因素考查、正交試驗(yàn)以及Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理,確定主要影響制備的因素為水化溫度(A)、藥脂比(B)、膽固醇與大豆磷脂質(zhì)量比(C),以替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率、載藥量和綜合評分為響應(yīng)值,每個(gè)因素設(shè) 3個(gè)水平,進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)[10]。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)表

    響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

    3.2.1 以包封率為響應(yīng)值觀察 利用Design-Expert 軟件進(jìn)行擬合分析,結(jié)果顯示(見表3和圖4),包封率與A、B、C 呈顯著線性關(guān)系(P<0.01)。得到模型的擬合曲線方程為包封率=56.77+2.28×A+9.33×B+9.4×C,即包封率=56.772 94+2.277 5×溫度+9.332 5×藥脂比+9.4×膽脂比。

    表3 包封率的響應(yīng)面方差分析表

    模型F值為16.57意味著模型是顯著的?!癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項(xiàng)是顯著的。在這種情況下,B、C是重要的模型項(xiàng)。大于0.100 0的值表示模型項(xiàng)不重要。該模型的失擬項(xiàng)P>0.1,不顯著,試驗(yàn)誤差較小,因此可用此模型對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

    A.溫度對包封率的影響效果圖;B.藥脂比對包封率的影響效果圖;C.膽脂比對包封率的影響效果圖圖4 單因素對包封率的影響效果圖

    替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝中影響包封率的主次因素順序?yàn)镃>B>A,即膽脂比的影響最大,藥脂比次之,水化溫度的影響最小。以包封率為指標(biāo),最佳處方工藝為A1B1C0,即水化溫度為60 ℃,藥脂比為1∶30,膽脂比為1∶5。

    3.2.2 以載藥量為響應(yīng)值觀察 利用Design-Expert 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析,結(jié)果顯示(見表4和圖5)模型的擬合曲線方程為載藥量=3.56+0.25×A-1.54×B+0.24×C-0.27×A×B+0.098 ×A×C-0.8×B×C-0.31×A2+1.02×B2+0.18×C2,即載藥量=3.556+0.247 5×溫度-1.536 25×藥脂比+0.238 75×膽脂比-0.267 5×溫度×藥脂比+0.097 5×溫度×膽脂比-0.805×藥脂比×膽脂比-0.305 5×溫度2+1.022×藥脂比2+0.177×膽脂比2。

    模型F值為32.65意味著模型是顯著的?!癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項(xiàng)是顯著的。在本例中,B、BC、B2是重要的模型項(xiàng)。大于0.100 0的值表示模型項(xiàng)不重要。該模型的失擬項(xiàng)不顯著,因此可用此模型對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

    表4 載藥量的響應(yīng)面方差分析表

    A.溫度與藥脂比對載藥量的影響效果圖;B.溫度與膽脂比對載藥量的影響效果圖;C.膽脂比與藥脂比對載藥量的影響效果圖圖5 不同因素對載藥量的影響效果圖

    在溫度與藥脂比的交互作用效果圖中可知,藥脂比的等高線分布較溫度的等高線分度密集,且響應(yīng)面3D圖形在藥脂比維度上的坡度變化較大。因此認(rèn)為在替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備工藝中,溫度的影響更為顯著,這一結(jié)論與表4中的因素顯著性結(jié)果一致。

    根據(jù)載藥量由Design Expert軟件獲得的最佳處方工藝為A1B1C0,即水化溫度為60 ℃,藥脂比為1∶30,膽脂比為1∶5。

    3.2.3 以綜合評分為響應(yīng)值觀察 根據(jù)Design-Expert 軟件進(jìn)行擬合分析,結(jié)果顯示(見表5和圖6),包封率與A,B,C 呈顯著線性關(guān)系(P<0.01)。得到模型的擬合曲線方程為綜合評分=30.37+1.26×A+3.9×B+4.82×C,即綜合評分=30.374 71+1.262 5×溫度+3.898 12×藥脂比+4.819 38×膽脂比。各因素影響效果見圖6。

    A.溫度對綜合評分的影響效果圖;B.藥脂比對綜合評分的影響效果圖;C.膽脂比對綜合評分的影響效果圖圖6 不同因素對綜合評分的影響效果圖

    模型F值為12.16意味著模型是顯著的。“Prob>F”值小于0.050 0表示模型項(xiàng)是顯著的。在這種情況下,B、C是重要的模型項(xiàng)。大于0.100 0的值表示模型項(xiàng)不重要。該模型的失擬項(xiàng)不顯著[8],因此可用此模型對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

    表5 綜合評分的響應(yīng)面方差分析表

    替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝中影響綜合評分的主次因素順序?yàn)镃>B>A,即膽脂比的影響最大,藥脂比次之,水化溫度的影響最小。以綜合評分為指標(biāo),最佳處方工藝為 A1B1C0,即水化溫度為60 ℃,藥脂比為1∶30,膽脂比為1∶5。

    4 討論與結(jié)論

    制備脂質(zhì)體過程中,膽固醇作為膜的流動(dòng)性調(diào)節(jié)劑,大豆磷脂和膽固醇比例的變化對膜的形成有關(guān)鍵影響;成膜后加入水化液在一定溫度下可形成脂質(zhì)體。包封率和載藥量是評價(jià)脂質(zhì)體制備工藝和質(zhì)量的重要指標(biāo),包封率反映了藥物被載體包封的程度,包封率越高,藥物被利用的程度越高,成本越低;載藥量的大小直接影響到藥物的臨床應(yīng)用劑量,故載藥量愈大,愈易滿足臨床需要。因此,本實(shí)驗(yàn)以包封率和載藥量為響應(yīng)值,通過單因素試驗(yàn)考察了水化溫度、藥脂比、膽脂比等因素對制備工藝的影響,通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了脂質(zhì)體的制備工藝,得到了替加環(huán)素脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝為水化溫度60 ℃、藥脂比為1∶30、膽脂比為1∶5,在此條件下制備的替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率為73.07%,載藥量為3.00%,綜合評分為38.03%。

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