去甲漢黃芩素抗膿毒癥潛在靶點(diǎn)的篩選與鑒定

柏慧，王新會(huì)，婁佳悅，李小清，陳桂榮

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

膿毒癥是重度燒傷、創(chuàng)傷、感染、休克和大手術(shù)等后常見的并發(fā)癥，由于宿主無法對(duì)感染的反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，繼而引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)癥候群，是臨床危重患者的主要死亡原因之一[1-3]。由流行病學(xué)研究可知，世界上每年有兩千萬左右的膿毒癥患者，其中進(jìn)展為重癥膿毒癥(severe sepsis)或膿毒癥休克(septic shock) 大約30%～40%，致死率高達(dá)25%～70%[4]。目前，關(guān)于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)正在不斷深入，但是對(duì)膿毒癥有效的治療方法的研究卻未能取得較好的成效。并且，當(dāng)前并無確切有效的臨床用藥。因此，對(duì)于預(yù)防和治療膿毒癥的有效藥物和治療方法的研究，是具有臨床意義和未來應(yīng)用價(jià)值的。

以往的研究表明黃連解毒湯對(duì)膿毒癥具有良好的治療作用，黃連解毒湯中含有的成分之一去甲漢黃芩素(見圖1)是一種黃酮類化合物，黃連解毒湯在我國(guó)臨床上有廣泛的應(yīng)用，有活血化瘀，止痛等多種藥理作用。經(jīng)研究，去甲漢黃芩不僅可以減少心肌缺血/再灌注損傷的梗死面積、改善心功能，還有其他重要作用，比如去除ROS并可降低白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)。而這些炎癥指標(biāo)以及心功能等調(diào)整跟膿毒癥都密切相關(guān)[5-8]。然而，去甲漢黃芩素抗膿毒癥的作用機(jī)制和靶點(diǎn)仍不清楚。以網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)為靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)是通過計(jì)算方法將化合物及其作用的目標(biāo)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的信息結(jié)合起來，通過識(shí)別活性小分子的作用蛋白，來探索小分子對(duì)于疾病的作用靶點(diǎn)以及機(jī)制，這是加快新藥開發(fā)的一種方法[9]。因此，在本文中，利用網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)及驗(yàn)證，進(jìn)而分析和篩選去甲漢黃芩素抗膿毒癥的潛在靶點(diǎn)。

圖1 去甲漢黃芩素化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料

去甲漢黃芩素sdf格式文件，Swiss TargetPrediction服務(wù)器(http://www.swisstargetprediction.ch)，TCMSP數(shù)據(jù)庫(DRAR-CPI服務(wù)器(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，分子對(duì)接服務(wù)器(http://systemsdock.unit.oist.jp)。

2 方法

2.1 藥理參數(shù)、分子特性評(píng)價(jià)與靶標(biāo)預(yù)測(cè) 熟悉并掌握化合物的藥理參數(shù)和化合物的分子特性對(duì)加深該化合物的成藥性能的理解以及明確合適的藥物劑型具有重要的意義，隨之而來減輕了藥物研發(fā)前期大量的篩選工作負(fù)擔(dān)。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫，評(píng)價(jià)去甲漢黃芩素體內(nèi)過程的藥代動(dòng)力學(xué)(ADME)[10]。

2.2 DRAR-CPI靶標(biāo)預(yù)測(cè) 新藥開發(fā)的第一步是靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，如何明確的篩選化合物的靶向蛋白藥是物開發(fā)的核心問題。DRAR-CPI服務(wù)器(https://cpi.bio-x.cn/drar)通過化學(xué)蛋白質(zhì)相互作用分析來預(yù)測(cè)化學(xué)成分的靶向蛋白。先將參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，然后將去甲漢黃芩素 (PubChem CID：5281674)的sdf文件上傳到DRAR-CPI服務(wù)器，最后篩選Z′-score<-0.5的靶向蛋白。

2.3 Swiss TargetPrediction靶標(biāo)預(yù)測(cè) 使用Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)服務(wù)器，并在Marvin for JavaScript Version 6.1上參照PubChem數(shù)據(jù)庫上傳去甲漢黃芩素 (PubChem CID：5281674)的結(jié)構(gòu)，繼而進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。

2.4 推測(cè)去甲漢黃芩素抗膿毒癥的靶標(biāo) 以DRAR-CPI及Swiss TargetPrediction服務(wù)器預(yù)測(cè)到共有的去甲漢黃芩素 靶向蛋白作為潛在靶標(biāo)信息同?倢?類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)、毒性與基因?倱?較數(shù)據(jù)庫(https://ctdbase.org/)和藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)中有關(guān)膿毒癥部分的靶標(biāo)與之相配，由此可以篩選出，既是膿毒癥的靶標(biāo)蛋白又是去甲漢黃芩素的靶標(biāo)蛋白，再將所得結(jié)果進(jìn)行分析歸納。

2.5 分子對(duì)接 先向(https://www.dockingserver.com/web/docking)分子對(duì)接服務(wù)器中輸入“2.1”和“2.2”項(xiàng)下提及的有關(guān)蛋白PDB的 ID，再向服務(wù)器上傳甲漢黃芩素 的sdf文件，進(jìn)行連接，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 藥理參數(shù)和分子特性評(píng)價(jià) 了解并掌握化合物的藥理參數(shù)和化合物的分子特性，就能夠加深對(duì)該化合物的成藥性能的理解，明確合適的藥物劑型，進(jìn)而減少藥物研發(fā)前期大量的篩選操作[11]。其中口服去甲漢黃芩素的體內(nèi)生物利用度(OB)是39.40%，比限量30%大，藥物相似度(DL)為0.21，比0.18大，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(RBN)為1，表明去甲漢黃芩素的口服吸收以及成藥性良好。藥物可以維持長(zhǎng)時(shí)間的療效，其半衰期(HL)為16.93，半衰期較長(zhǎng)，建議做成普通口服制劑。去甲漢黃芩素 ，分子量(MW)為270.25 Da，比500 Da小，油水分配系數(shù)為2.33，比5小，氫鍵供體為3和氫鍵受體為5，均接近5，與Lipinski′s[12]的5原則較為統(tǒng)一，說明成藥可能性較高。

3.2 靶標(biāo)預(yù)測(cè) 靶標(biāo)預(yù)測(cè)是新藥開發(fā)的第一步，如何明確篩選化合物的靶向蛋白已經(jīng)成為藥物開發(fā)的核心問題[9]。這一目的通過分子反向預(yù)測(cè)靶標(biāo)的計(jì)算釣靶方法已經(jīng)逐漸被推廣開來。通過DRAR-CPI共篩選出392個(gè)靶標(biāo)，在Swiss TargetPrediction服務(wù)器中進(jìn)行篩選，獲得15個(gè)去甲漢黃芩素的相關(guān)靶點(diǎn)；結(jié)果中 Z′<-0.5的靶標(biāo)共95個(gè)，(Z′<-0.5表明具有良好的靶向性)；再將Swiss TargetPrediction服務(wù)器和DRAR-CPI篩選到靶點(diǎn)合并，把重復(fù)靶點(diǎn)刪除，最后共得到105個(gè)靶點(diǎn)。

在人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(OMIM),毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(CTD)和藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(TTD)中輸入 “sepsis”，從毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(CTD)篩選到26個(gè)靶標(biāo)蛋白，人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(OMIM)篩選到117個(gè)靶標(biāo)蛋白，藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(TTD)篩選到21個(gè)蛋白，其中共有疾病靶標(biāo)149個(gè)，把預(yù)測(cè)到的105個(gè)去甲漢黃芩素的靶標(biāo)蛋白和疾病靶標(biāo)匹配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)既是分子靶標(biāo)又是疾病靶標(biāo)的蛋白有7個(gè)[即：絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、組織蛋白酶G(CTSG) 、蛋白C(PROC) 、凝血因子Ⅸ(F9)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、人雌激素受體β(ESR2) ]，具體篩選流程見圖2。

圖2 去甲漢黃芩素靶標(biāo)鑒定流程圖

3.3 分子對(duì)接 在本實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)去甲漢黃芩素和相關(guān)蛋白，基于使用dockingserver分子對(duì)接服務(wù)器，進(jìn)行了分子對(duì)接。結(jié)果見表1，計(jì)算結(jié)果的自由結(jié)合能小于-5 kcal·mol-1的靶標(biāo)有CTSG、ESR2、F9、PNP和MAPK1，由計(jì)算結(jié)果可以得出去甲漢黃芩素具有結(jié)合這些靶標(biāo)的能力[13]。

從圖3可以看出去甲漢黃芩素與ESR2的疏水相互作用殘基包括PHE356、MET336、LEU343、LEU301、ALA302、MET340、LEU476、THR299、ILE376、ILE373、ARG346以及GLU305。去甲漢黃芩素與PNP的疏水相互作用殘基包括SER220、ARG84、SER33、TYR88、HIS86、TYR192、PHE200、MET219、VAL217、ASN115以及GLU201。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論：去甲漢黃芩素可能會(huì)通過這些具有關(guān)鍵性的殘基與PNP和ESR2發(fā)生交互作用，從而才可以發(fā)揮藥物作用。

表1 去甲漢黃芩素與靶標(biāo)蛋白相互作用分子對(duì)接數(shù)據(jù)如下表所示

膿毒癥及其引發(fā)的休克和多器官衰竭是成人重癥監(jiān)護(hù)病房死亡的主要原因。雖然膿毒癥治療的外科方法和藥理學(xué)研究正在不斷改進(jìn)，但流行病學(xué)研究表明，在過去20年中，膿毒癥的發(fā)生率明顯增加[14]。因此尋找有效的藥物一直是研究的熱點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)去甲漢黃芩素可能通過結(jié)合CTSG、ESR2、F9、PNP和MAPK1等蛋白起到抗膿毒癥作用。

膿毒癥發(fā)生時(shí)，凝血系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)被激活，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致膿毒癥患者多器官功能衰竭甚至死亡[15-16]，而凝血因子F9參與凝血的內(nèi)在途徑，跟膿毒癥密切相關(guān)[17]。研究表明膿毒癥大鼠下丘腦中樞的雌激素受體ESR2表達(dá)量降低，且炎癥介質(zhì)與雌激素受體表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而大多數(shù)膿毒癥患者存在雌激素水平的紊亂，推測(cè)雌激素能緩解膿毒癥所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)保護(hù)機(jī)體各個(gè)器官[18]。脂多糖(LPS)是引起膿毒癥的主要原因，能介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)，炎性介質(zhì)能激活不同MAPK以促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控其他炎性介質(zhì)的生成，MAPKI基因在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。p38MAPK通路能夠調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)展，密切參與膿毒癥[19]，MAPK1是p38MAPK通路關(guān)鍵的信號(hào)物質(zhì)，研究表明在膿毒癥大鼠中肺組織以及心肌組織的MAPK1表達(dá)均顯著升高，表明通過調(diào)節(jié)MAPK1能起到保護(hù)膿毒癥造成的肺組織及心肌組織的損傷[20-21]。CTSG作為一種絲氨酸類蛋白酶，可以水解活化前IL-1β以及TNF-α等細(xì)胞因子參與炎癥部位病原體清除、消化、吞噬和結(jié)締組織的重塑，在炎癥性疾病產(chǎn)生和發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要的作用，而全身炎癥反應(yīng)是膿毒癥的經(jīng)典癥狀同時(shí)它還往往伴隨著急性肺損傷等[22]。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤核苷酸磷解的必需酶，該酶的先天性缺陷會(huì)通過選擇性耗竭T細(xì)胞而導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷綜合征，而膿毒癥的發(fā)生發(fā)展跟T細(xì)胞密切相關(guān)[23]。內(nèi)源性活化PROC可以通過其抗炎作用來抑制膿毒癥凝血和抗炎反應(yīng)，PROC可以通過抑制凝血酶的形成進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，從而干擾脂多糖與胞膜上受體CD14的相互作用等。F9是一類具有絲氨酸蛋白酶活性的凝血因子。因此，去甲漢黃芩素可能通過與靶向蛋白PROC和F9結(jié)合，進(jìn)而抑制凝血并減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)。

A.ESR2與去甲漢黃芩素分子對(duì)接圖；B.ESR2與去甲漢黃芩素的2D交互配圖；C.PNP與去甲漢黃芩素分子對(duì)接圖；D.PNP與去甲漢黃芩素的2D交互配圖圖3 去甲漢黃芩素與ESR2和PNP分子相互作用

綜上，去甲漢黃芩素能通過調(diào)節(jié)F9參與凝血系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)ESR2維持雌激素水平的穩(wěn)定，通過調(diào)節(jié)CTSG、MAPK1和PNP起到保護(hù)膿毒癥損傷器官的作用，最終通過緩解膿毒癥的癥狀及炎癥等水平起到抗膿毒癥作用。