NLRP3炎性小體與妊娠相關(guān)疾病*

馮曉玲， 姜天悅， 張 楊△

1黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科二科，哈爾濱 150040 2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040

炎性反應(yīng)是機(jī)體常見(jiàn)的生理、病理活動(dòng)，是一種因潛在有害刺激而啟動(dòng)的防御反應(yīng)[1]。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體作為宿主先天免疫系統(tǒng)的促炎因子，是具有雙重作用的多蛋白復(fù)合物，響應(yīng)多種外源性病原微生物和內(nèi)源性應(yīng)激相關(guān)信號(hào)分子，通過(guò)炎性反應(yīng)和細(xì)胞死亡機(jī)制發(fā)揮先天免疫調(diào)節(jié)作用[2]，清除病原體，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，但是過(guò)度活化的NLRP3炎性小體會(huì)導(dǎo)致多種疾病。在生殖生物學(xué)背景下，NLRP3炎性小體在人類子宮內(nèi)膜和胎盤(pán)中大量表達(dá)，與早產(chǎn)(preterm delivery,PTD)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)、子癇前期(preeclampsia,PE)等疾病的病理生理過(guò)程有很強(qiáng)的相關(guān)性[3]。

1 概述

1.1 NLRP3炎性小體的構(gòu)成和功能

固有免疫是機(jī)體抵御外來(lái)入侵的第一道防線，主要通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，例如胞外Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和胞內(nèi)NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)，激活相關(guān)炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)而啟動(dòng)防御機(jī)制[4]。部分PRR可以募集下游的接頭蛋白形成炎性小體復(fù)合物，促使白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)和IL-18等炎性介質(zhì)成熟、分泌，發(fā)生炎癥反應(yīng)。目前，對(duì)于NLRP3炎性小體的研究最為廣泛[5]。

NLRP3炎性小體是高分子量胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和pro-Caspase-1組成。NLRP3可在各類激動(dòng)劑的作用下募集ASC，通過(guò)ASC結(jié)合pro-Caspase-1形成NLRP3炎性小體。活化的NLRP3炎性小體將pro-Caspase-1剪切為具有生物活性的半胱天冬酶-1(Caspase-1)。Caspase-1既可裂解IL-1β和IL-18的前體，促進(jìn)其成熟與分泌，也可裂解Gasdermin D蛋白(GSDMD)引起細(xì)胞焦亡[6]。病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)信號(hào)都可以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化。因此，NLRP3炎性小體一方面可識(shí)別病毒、細(xì)菌等病原微生物，輔助抵御外來(lái)威脅；另一方面可識(shí)別內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)，例如膽固醇結(jié)晶、尿酸鹽結(jié)晶、高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)、細(xì)胞外碎片，細(xì)胞外囊泡和游離脂肪酸等，在消除機(jī)體異常狀態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。NLRP3炎性小體活化失調(diào)的影響已經(jīng)在關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制中得到證實(shí)。近年研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體在人類母胎界面的異常激活參與了多種妊娠綜合征，特別是不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(URSA)、PTD和PE的病理機(jī)制[8]，說(shuō)明以NLRP3炎性小體為靶標(biāo)的干預(yù)治療可能是改善妊娠相關(guān)疾病預(yù)后的一種有效手段。

1.2 NLRP3炎性小體的活化機(jī)制

NLRP3炎性小體主要在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)[5]。目前研究認(rèn)為NLRP3炎性小體的活化機(jī)制主要有3種：一是活性氧(ROS)增加。研究發(fā)現(xiàn)，多種NLRP3炎性小體活化劑可引起線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體ROS增多[9]，乙酰半胱氨酸作為ROS抑制劑，能大幅減少細(xì)胞內(nèi)Caspase-1表達(dá)和IL-1β的釋放。而且，NLRP3炎性小體的激活可同時(shí)募集NLRP3和ASC組分蛋白向線粒體遷移，說(shuō)明了線粒體損傷、ROS增加在NLRP3炎性小體激活過(guò)程中的重要作用[10]。二是鉀離子外流，也被認(rèn)為是炎性小體活化的早期信號(hào)。提高胞外鉀離子的濃度，可抑制NLRP3炎性小體活化；使用不含鉀離子的培養(yǎng)液，誘導(dǎo)胞內(nèi)鉀離子外流可以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化，說(shuō)明NLRP3炎性小體的活化過(guò)程伴隨鉀離子外流[11]。三是溶酶體破碎。研究顯示，大的結(jié)晶樣物質(zhì)被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞后，因無(wú)法被降解導(dǎo)致溶酶體損傷或破碎，釋放組織蛋白酶B進(jìn)入胞質(zhì)，可導(dǎo)致NLRP3炎性小體的活化[7]。另外，除了鉀離子外流，Ca2+和Cl-的流動(dòng)，NIMA相關(guān)蛋白激酶7也參與了NLRP3炎性小體的活化過(guò)程[12]。目前認(rèn)為NLRP3炎性小體活化的經(jīng)典途徑包括2個(gè)階段[13]：首先，在激活之前，NLRP3在大多數(shù)類型細(xì)胞中啟動(dòng),核因子kB刺激脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可上調(diào)NLRP3和IL-1β mRNA表達(dá)，使NLRP3和pro-IL-1β蛋白表達(dá)升高;之后，通過(guò)NLRP3的泛素降解促進(jìn)NLRP3炎性小體的快速誘導(dǎo)[14]。

2 NLRP3炎性小體與妊娠相關(guān)疾病

炎癥是機(jī)體對(duì)有害刺激物(例如病原體，受損或死亡細(xì)胞以及刺激物)復(fù)雜的保護(hù)性免疫反應(yīng)，受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，使組織在感染或受損后能夠存活并保持穩(wěn)態(tài)。從母體免疫系統(tǒng)的角度來(lái)看，胚胎作為半同種異體組織易受到母體排斥。然而在生理妊娠中，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞在適度的促炎環(huán)境下，侵入子宮黏膜并與各種母體免疫細(xì)胞直接對(duì)話，形成免疫耐受。免疫炎性反應(yīng)所介導(dǎo)的組織生長(zhǎng)、重塑和分化過(guò)程對(duì)于維持妊娠至關(guān)重要，而異常炎性反應(yīng)與多種妊娠并發(fā)癥相關(guān)聯(lián)[15](圖1)。有證據(jù)表明，NLRP3炎性小體在PTD患者的絨毛膜、RSA患者的子宮內(nèi)膜和PE患者的胎盤(pán)中過(guò)表達(dá)[16]。

2.1 早產(chǎn)(PTD)

PTD定義為在妊娠37周前分娩，是全球圍產(chǎn)兒發(fā)病和死亡的主要原因，發(fā)病率約為10%，其中70%為自發(fā)性早產(chǎn)(其余為醫(yī)源性早產(chǎn))。目前自發(fā)性早產(chǎn)公認(rèn)的誘因是羊膜內(nèi)炎癥(intra-amniotic inflammation，IAI)或感染[17]。IAI可由微生物(細(xì)菌、病毒或真菌)感染引發(fā)。Gomez-Lopez等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與沒(méi)有胎盤(pán)病變的早產(chǎn)女性相比，取自自發(fā)性早產(chǎn)女性的絨毛膜羊膜、急性絨毛膜羊膜炎的組織，表達(dá)更高濃度的炎性小體組分(Caspase-1，Caspase-4，ASC/CASP-1復(fù)合體，IL-1β，IL-18)。Faro等[19]以LPS誘導(dǎo)建立IAI動(dòng)物模型，觀察發(fā)現(xiàn),在發(fā)生早產(chǎn)之前NLRP3炎性小體己在轉(zhuǎn)錄水平啟動(dòng)，表現(xiàn)為炎性小體相關(guān)基因(Caspase-1，IL-1β)mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，并且胎膜和基蛻膜中NLRP3蛋白水平升高。體內(nèi)使用特定的NLRP3抑制劑MCC950治療后，降低了IAI引發(fā)的早產(chǎn)和新生兒死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性PTD婦女的絨毛膜提取物中，HMGB1的濃度高于足月自然分娩的婦女。HMBG1屬于警示蛋白家族，它的釋放發(fā)生在炎性小體組裝和Caspase-1激活的下游，當(dāng)組織受到感染或損傷時(shí)，活化免疫細(xì)胞和受損細(xì)胞將HMGB1釋放到細(xì)胞外空間，成為一種促炎介質(zhì)。研究表明，在絨毛膜中孵育HMGB1可上調(diào)炎性小體NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)成熟Caspase-1和IL-1β的釋放，說(shuō)明HMGB1對(duì)NLRP3的激活起正反饋?zhàn)饔肹20]?？梢?jiàn)，NLRP3炎性小體的激活參與了感染誘發(fā)PTD患者絨毛膜的先天免疫炎性反應(yīng)。

然而，大多數(shù)自發(fā)性早產(chǎn)合并羊膜內(nèi)炎癥的病例是在沒(méi)有微生物侵?jǐn)_的情況下發(fā)生的[21]，提示炎癥可能源自壞死或細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，即由DAMP激活NLRP3炎性小體誘發(fā)“無(wú)菌”炎癥[8]。研究人員借助超聲引導(dǎo)在妊娠小鼠羊膜內(nèi)注射警報(bào)蛋白S100B，引發(fā)了較高的早產(chǎn)率(50%)和新生兒死亡率(59.7%)。采用多重細(xì)胞因子陣列和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，S100B引起羊膜腔內(nèi)促炎反應(yīng)，誘導(dǎo)胎膜NLRP3炎性小體激活，表現(xiàn)為NLRP3蛋白上調(diào)，活化Caspase-1和成熟IL-1β的釋放增加。通過(guò)特異性抑制劑MCC950抑制NLRP3炎性小體，可將早產(chǎn)率降低35.7%，新生兒死亡率降低26.7%[22]，證明危險(xiǎn)信號(hào)分子激活NLRP3炎性小體，參與了非感染相關(guān)PTD的發(fā)病機(jī)制，也為針對(duì)無(wú)菌性羊膜內(nèi)炎癥可通過(guò)靶向NLRP3炎性小體進(jìn)行干預(yù)提供了證據(jù)。

2.2 不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(URSA)

RSA是指連續(xù)2次或2次以上與同一性伴受孕且在孕20周之前自然流產(chǎn)，在妊娠女性中的發(fā)病率約為3%～5%。RSA病因復(fù)雜，除已知的解剖學(xué)、內(nèi)分泌、基因、免疫和感染等因素外，仍有約40%的病例無(wú)法解釋病因，也稱為URSA。母胎界面抗炎和促炎因子的平衡在形成免疫耐受、維持妊娠中發(fā)揮重要作用，URSA與異常的免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)[23]。在URSA女性的子宮內(nèi)膜組織中，NLRP3炎性小體表達(dá)顯著增加，呈Caspase-1依賴性分泌IL-1β和IL-18。因此，NLRP3炎性小體可能代表一個(gè)新的子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)記蛋白家族。炎性小體異常激活，參與了非容受性子宮內(nèi)膜的分子機(jī)制，導(dǎo)致孕早期胎兒丟失[24]。雖然IL-1β對(duì)母胎免疫耐受的形成和產(chǎn)前子宮頸成熟具有重要作用，但I(xiàn)L-1β在絨毛和蛻膜中的過(guò)量表達(dá)容易誘發(fā)不良妊娠結(jié)局[25]。研究人員利用LPS刺激，在URSA患者絨毛與蛻膜組織中激活炎性小體，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體在URSA組織中的表達(dá)明顯高于無(wú)并發(fā)癥自愿選擇中止妊娠的對(duì)照組。過(guò)度活化的NLRP3炎性小體可介導(dǎo)母胎界面異常的炎癥反應(yīng)，造成滋養(yǎng)細(xì)胞活力降低，遷移和增殖能力不足，使胚胎著床困難，導(dǎo)致妊娠失敗。而且，炎癥狀態(tài)下的滋養(yǎng)細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的M1型(促炎)功能，進(jìn)一步擴(kuò)大母胎界面的炎癥反應(yīng)[26]。另外，Tersigni等[27]發(fā)現(xiàn)URSA患者腸道通透性異常升高，并檢測(cè)到更高的血漿LPS(NLRP3炎性小體的強(qiáng)力激活物)水平，認(rèn)為URSA女性腸道細(xì)菌成分可能進(jìn)入母體循環(huán)，激活NLRP3炎性小體，引起廣泛的促炎細(xì)胞因子分泌，當(dāng)脆弱的子宮內(nèi)膜組織受到感染時(shí)，可出現(xiàn)免疫反應(yīng)失調(diào)，引發(fā)URSA。生理妊娠中母胎界面的細(xì)胞和分子處于免疫平衡狀態(tài)，當(dāng)Th17/Treg、Th1/Th2平衡狀態(tài)被打破并傾向于促炎癥狀態(tài)時(shí)，母體和胎兒會(huì)產(chǎn)生相互排斥，最終導(dǎo)致胎兒丟失[28]。Lu等[29]研究表明，URSA患者外周血單核細(xì)胞和蛻膜組織中NLRP3炎性小體的表達(dá)與CD4+IL-17A+水平呈正相關(guān)，而與CD4+CD25+Treg細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。URSA小鼠模型也顯示類似的結(jié)果。使用Caspase-1抑制劑YVAD后，檢測(cè)URSA小鼠CD4+IL-17A+和CD4+CD25+Treg水平，結(jié)果表明，YVAD治療后CD4+CD25+Treg水平升高，CD4+IL-17A+水平下調(diào)，提示激活的NLRP3炎性小體通過(guò)調(diào)節(jié)Th17和Treg之間的平衡，參與了URSA的發(fā)病機(jī)制。

2.3 子癇前期(PE)

PE是指妊娠20周后出現(xiàn)高血壓伴蛋白尿的綜合征[3]。目前學(xué)者認(rèn)為PE的核心病理機(jī)制是胎盤(pán)形成不良，血液灌注不足，使炎性因子和細(xì)胞碎片釋放入血，母體出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙[30]。在探尋PE病理機(jī)制的過(guò)程中，Mulla和Xie等[31-32]率先提出NLRP3炎性小體的異常激活與PE相關(guān)。之后，多項(xiàng)研究證明PE女性樣本中NLRP3及相關(guān)介質(zhì)(如Caspase-1，IL-1β，IL-18，TNF-α和HMGB1)的表達(dá)顯著升高[33-34]。

研究發(fā)現(xiàn)，PE的病因——胎盤(pán)發(fā)育不良與NLRP3炎性小體參與的滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡密切相關(guān)[28]。細(xì)胞焦亡是具有促炎和細(xì)胞溶解性質(zhì)的新型細(xì)胞程序性死亡途徑，是機(jī)體應(yīng)對(duì)感染的免疫防御機(jī)制，但是過(guò)度細(xì)胞焦亡引發(fā)的異常炎性反應(yīng)和免疫細(xì)胞大量死亡，會(huì)使宿主免疫功能嚴(yán)重受損[35]。在早發(fā)PE分娩的胎盤(pán)組織、正常人類滋養(yǎng)細(xì)胞(暴露于低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激源)，以及PE患者血清中，均檢測(cè)到焦亡相關(guān)炎癥標(biāo)記物Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)證明，慢性病理刺激(如缺氧)引起過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，過(guò)度激活未折疊蛋白反應(yīng)，提高了硫氧化還原蛋白相互作用蛋白(TXNIP)水平，隨后觸發(fā)NLRP3炎性小體激活，增加活性Caspase-1的生成，將IL-18/IL-1β前體和GSDMD前體分別裂解為成熟IL-18/IL-1β和GSDMD的N端片段(NT-GSDMD)。NT-GSDMD易位至質(zhì)膜并形成膜孔，釋放包括DAMP在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物，使組織出現(xiàn)無(wú)菌炎癥[36]。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)PE胎盤(pán)合胞滋養(yǎng)細(xì)胞微囊泡和納米囊泡進(jìn)入母體循環(huán)，在體外試驗(yàn)中顯示可發(fā)揮促炎、抗內(nèi)皮和促凝活性。這些微?？梢宰鳛镈AMP，誘導(dǎo)炎性小體超活化，導(dǎo)致過(guò)度的炎癥狀態(tài)。Kohli等[38]進(jìn)行的小鼠研究顯示，小鼠內(nèi)皮衍生的胞外囊泡可致胎盤(pán)血管床內(nèi)活化血小板積累。這一現(xiàn)象與胎盤(pán)NLRP3炎性小體血小板依賴性激活有關(guān)，引發(fā)了PE樣表型。不僅如此，胎盤(pán)炎性小體激活的遺傳和藥理學(xué)抑制都解除了PE樣表型，說(shuō)明胞外囊泡誘導(dǎo)的炎性小體激活是妊娠綜合征發(fā)病機(jī)制的一個(gè)中心機(jī)制，并揭示了一種新的母胎界面血栓炎癥機(jī)制。St?dle等[39]證實(shí)，補(bǔ)體成分C5a等因子的初始活化可促進(jìn)NLRP3炎性小體對(duì)結(jié)晶膽固醇和尿酸的反應(yīng)，并誘導(dǎo)IL-1β在發(fā)生炎癥的PE胎盤(pán)合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞中過(guò)度加工，發(fā)生胎盤(pán)炎癥?？梢?jiàn)，多種內(nèi)源性DAMP，如膽固醇、尿酸結(jié)晶、細(xì)胞外DNA、HMGB1蛋白、細(xì)胞外細(xì)胞碎片、游離脂肪酸和晚期糖基化終末產(chǎn)物在PE患者外周血和胎盤(pán)中過(guò)表達(dá)，并成為母體血清和(或)應(yīng)激胎盤(pán)組織內(nèi)NLRP3炎性小體的激活劑[39-40]。

3 靶向干預(yù)治療前景

NLRP3炎性小體異常激活可通過(guò)多種途徑影響女性的生殖健康和妊娠結(jié)局。針對(duì)NLRP3炎性小體的治療和管理方法可能有助于改善此類疾病的預(yù)后。目前已有多種小分子在細(xì)胞水平展現(xiàn)出抑制NLRP3炎性小體過(guò)度激活的作用，部分抑制劑在相應(yīng)疾病的動(dòng)物模型中獲得了預(yù)期的預(yù)防或治療效果[5]。在生殖領(lǐng)域，已證明miR-520c-3p[41]、miR-223[42]、miR-9[43]可以抑制NLRP3炎性小體激活。一項(xiàng)初步研究證明，NLRP3炎性小體抑制劑MCC950在人類臨床使用顯示安全，而且足月時(shí)實(shí)施抑制并未阻礙分娩的生理過(guò)程，說(shuō)明NLRP3炎性小體有望成為預(yù)防和治療早產(chǎn)的靶點(diǎn)[44]。抑制劑格列本脲(glibenclamide)也可降低人類滋養(yǎng)細(xì)胞中炎性小體的激活，突出了靶向NLRP3炎性小體治療胎盤(pán)疾病的潛力[45]。另一種抑制劑β-羥丁酸可以降低NLRP3炎性小體介導(dǎo)的疾病小鼠模型中Caspase-1的激活和IL-1β的分泌。而且，白藜蘆醇[46]和桑葚[47]提取物可調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體激活引起的炎癥反應(yīng)。未來(lái)，仍需高質(zhì)量的研究進(jìn)一步評(píng)估NLRP3炎性小體抑制劑在妊娠相關(guān)疾病防治中的有效性和安全性。

在人類妊娠過(guò)程中，NLRP3炎性小體作為炎癥反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)參與先天免疫調(diào)節(jié)，一旦異常激活，所釋放的過(guò)量促炎因子易破壞機(jī)體和組織促炎與抗炎蛋白的生理平衡，通過(guò)過(guò)度炎性反應(yīng)和細(xì)胞異常死亡，導(dǎo)致早產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和子癇前期等妊娠并發(fā)癥。未來(lái)需要更深入的研究，探討NLRP3炎性小體活性失調(diào)影響妊娠并發(fā)癥的機(jī)制，包括精準(zhǔn)調(diào)控NLRP3炎性小體活化的方法，找到更加安全、有針對(duì)性的治療策略。