種子果實(shí)類中藥DNA條形碼鑒定的研究進(jìn)展

姜 波

隨著中醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)中醫(yī)中藥的關(guān)注程度不斷上升，中藥的需求量也在不斷增加。中藥材的質(zhì)量直接決定了中醫(yī)治療效果，中藥質(zhì)量對(duì)臨床治療至關(guān)重要[1]。傳統(tǒng)草本記載差異和中藥命名復(fù)雜、地域廣闊有關(guān)，并且存在同物異名或同名異物的情況，還存在偽品和部分混淆的情況，導(dǎo)致中藥市場(chǎng)混亂，各地區(qū)存在用藥差異等問題，直接影響中藥的穩(wěn)定性和療效性。對(duì)于中藥材種子果實(shí)類品種通過DNA條形碼技術(shù)鑒別，能夠擺脫物種的外觀形態(tài)特征和鑒別人員專業(yè)水平限制，更加客觀地避免干擾和主觀性影響，提高鑒定的準(zhǔn)確性[2]。本文通過分析DNA條碼鑒別種子果實(shí)類中藥的研究進(jìn)展，為中藥準(zhǔn)確鑒別研究提供參考和依據(jù)。

1 DNA條碼鑒定技術(shù)

1.1 鑒定意義DNA條碼技術(shù)于2003年首次提出，通過對(duì)中藥材基源物種PCR增擴(kuò)片段的分析，比對(duì)增擴(kuò)產(chǎn)物序列情況，尋找DNA條碼后再有目的的構(gòu)建條碼進(jìn)行系統(tǒng)識(shí)別。DNA條碼鑒別是通過較短的DNA序列進(jìn)行物種鑒別，該種分子生物學(xué)鑒別方法被稱為DNA條形碼鑒定技術(shù)[3]。通過DNA條形碼技術(shù)鑒別中藥，可以建立健全DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，確立標(biāo)準(zhǔn)化的DNA鑒定操作流程，以實(shí)現(xiàn)中藥材分子生物學(xué)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化[4]。中藥DNA條碼鑒別主要意義在于：對(duì)傳統(tǒng)中藥鑒定方法作以補(bǔ)充，促進(jìn)中藥資源的利用和開發(fā)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)中藥鑒定方法人才不足情況，保護(hù)中藥資源生物多樣性，尋找形態(tài)學(xué)難以確認(rèn)的隱種，利于中藥市場(chǎng)監(jiān)督管理。

1.2 序列選擇2009年國(guó)際會(huì)議確定將葉綠體中的2個(gè)基因片段作為植物鑒別的核心DNA條碼，建議將核基因片段作為DNA條碼的補(bǔ)充條碼。相關(guān)研究表明在選擇的900余個(gè)樣品中，DNA條碼能夠鑒別出500余個(gè)品種，成功率高達(dá)70%以上[5]。2013年《中華人民共和國(guó)藥典》增補(bǔ)本將中藥DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，通過對(duì)大量中藥進(jìn)行DNA條碼鑒定研究，并建立了條碼鑒定體系，其中對(duì)動(dòng)物類和植物類藥材的DNA條形碼體系進(jìn)行確立。

1.3 序列選擇標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列圖譜之間的鑒別，需要鑒別物種之間有較大的序列差異，在選擇目標(biāo)序列中應(yīng)選擇有種間序列差異較大或有變異位點(diǎn)的序列，利于物種之間的鑒別，種內(nèi)和種間存在清晰界限。DNA序列兩端應(yīng)便于引物序列擴(kuò)增和涉及；選擇序列應(yīng)盡可能簡(jiǎn)短便于DNA擴(kuò)增。

2 DNA條碼鑒定的應(yīng)用

中藥產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，中藥材提取技術(shù)不斷更新，中藥材提取逐步工業(yè)化、規(guī)?；?，導(dǎo)致中藥材植物和動(dòng)物的數(shù)量不斷減少。中藥材開發(fā)受到物種資源短缺或滅絕的限制，為了尋找更多具有藥用價(jià)值的可代替?zhèn)鹘y(tǒng)中藥材的生物資源，在中藥鑒別方面便于尋找潛在資源物種，通過DNA條碼測(cè)序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分析物種間遺傳關(guān)系，利于發(fā)現(xiàn)分子水平上密切聯(lián)系的物種，尋找可以代替的潛在資源。研究顯示，通過10批樣本進(jìn)行DNA條形碼鑒別，能將2批次混入的其他物種準(zhǔn)確鑒別[6]。

3 DNA條碼鑒別方法及注意事項(xiàng)

3.1 方法先對(duì)被鑒別物種進(jìn)行樣本采集，先進(jìn)行DNA提取和對(duì)PCR擴(kuò)增的測(cè)序工作，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，尋找被鑒別種屬的對(duì)應(yīng)DNA序列[7]。挑選飽滿的種子果實(shí)，提取總DNA，取樣本0.3 g，用雙氧水浸泡30 min，用蒸餾水沖洗數(shù)次，在紫外燈光下照射15 min，除去外源的DNA，用石英砂冰浴研磨，預(yù)熱后取緩沖液2 ml，在水域中振搖提取，高速離心，上清液加入醋酸鉀溶液，倒入離心管中加入氯仿-異戊醇混均，反復(fù)顛倒后離心，再重復(fù)以上操作，離心后去掉乙醇，將溶液倒在吸水紙上用風(fēng)機(jī)吹干，用冷凍冰箱保存。

3.2 注意事項(xiàng)在DNA采集和測(cè)序工作中，應(yīng)注意細(xì)節(jié)操作，避免樣品攜帶的污染，在取樣時(shí)避免交叉污染，試劑污染，操作人員污染等[8]。對(duì)于潔凈度要求高的操作步驟應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。做好試驗(yàn)記錄，出現(xiàn)問題或偏差后及時(shí)查找原因。實(shí)驗(yàn)人員在操作中應(yīng)佩戴口罩、手套，穿戴好隔離服。按照試劑使用說明要求進(jìn)行操作，對(duì)于有毒、有害試劑應(yīng)做好人身保護(hù)。排查數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)中各種干擾因素、儀器設(shè)備誤差等原因，以保證實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性。

3.3 實(shí)例分析種子類藥材菟絲子的近緣物種多達(dá)45份，按照207條ITS2序列構(gòu)建菟絲子的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合克隆測(cè)序，對(duì)從藥材市場(chǎng)、醫(yī)院、藥店購(gòu)買的菟絲子藥材進(jìn)行鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%市面銷售的菟絲子藥材存在混偽情況[9]?；靷蔚奈锓N包括埃塞俄比亞芥、茴香、大頭菜、大豆、日本菟絲子、紫苜蓿等。說明采用DNA條形碼鑒定種子果實(shí)類藥材和市場(chǎng)監(jiān)督均有較好作用。

4 DNA條碼鑒別存在的問題

采用DNA條形碼技術(shù)鑒別的前提為確定需要鑒別的中藥基原的真?zhèn)纹肥欠襁M(jìn)化完全，只有進(jìn)化完全的樣本才能進(jìn)行該種方法的鑒別，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行DNA條碼鑒別，結(jié)果會(huì)相對(duì)客觀。在鑒別植物DNA時(shí)，多采用新鮮植物葉片作為樣本，經(jīng)過炮制或加工過的中藥飲片則無法進(jìn)行DNA鑒別，結(jié)果回收到DNA斷裂或降解的影響，需要進(jìn)一步實(shí)踐[10]。中藥DNA條碼鑒別中難以獲得完整的模板，在采集、貯藏過程中中藥樣本會(huì)因很多條件變換發(fā)生簡(jiǎn)介，導(dǎo)致能夠檢測(cè)的DNA片段較小。因自身的局限性不能對(duì)礦物質(zhì)藥材進(jìn)行鑒別，不能在所有中藥中施展，應(yīng)與傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合，單純使用DNA條形碼鑒別技術(shù)不能保證中藥鑒別的全面性和準(zhǔn)確性。

5 DNA條碼鑒別解決方案

在采集和存放樣本過程中應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范要求進(jìn)行操作，避免因外界環(huán)境影響，使樣本種的DNA發(fā)生降解或遭到破壞。植物樣本應(yīng)盡量采集新鮮葉片，保證完整序列和擴(kuò)增模板。加強(qiáng)基因組的測(cè)序研究，對(duì)基因組資料進(jìn)行豐富，以選擇更小的基因片段[11]。動(dòng)植物分類學(xué)中DNA條碼鑒別技術(shù)較成熟，中藥材鑒別應(yīng)用較廣泛，為質(zhì)量監(jiān)管提供新方法。

6 前景展望

雖然2003年就提出了DNA條形碼理論，并且在動(dòng)植物鑒別方面有顯著成效。但DNA條碼鑒別技術(shù)還多停留在實(shí)驗(yàn)研究階段，不能單獨(dú)走出實(shí)驗(yàn)室，需要通過現(xiàn)代化的電子設(shè)備進(jìn)行生物鑒別。設(shè)備上的要求給DNA條形碼鑒定技術(shù)的應(yīng)用推廣提出挑戰(zhàn)，不能廣泛應(yīng)用在中藥材鑒別上，樣本的要求不能將DNA條形碼鑒定技術(shù)應(yīng)用在中成藥的鑒別中。但隨著鑒別技術(shù)研究的不斷深入，某些研究已經(jīng)從人參中藥中提取到DNA，并能成功擴(kuò)增核糖體序列，已完成人參混偽品的鑒別[12]。隨著DNA序列碼數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步建立，將二維碼作為DNA序列信息的載體，通過掃描二維碼信息實(shí)現(xiàn)中藥鑒別的信息化[13]。不斷完成中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，必將使DNA條碼技術(shù)發(fā)揮出智能、快捷、可靠的鑒別作用。希望不久的將來，中成藥真?zhèn)舞b別也能通過DNA條形碼完成。

7 小結(jié)

DNA條形碼鑒定技術(shù)可以擺脫中藥動(dòng)植物物種形態(tài)特征、操作者水平、動(dòng)植物生長(zhǎng)階段等限制，提高鑒定的準(zhǔn)確性和通用性[14]。將10個(gè)堿基組成的任意序列核苷酸片段進(jìn)行基因組PCR擴(kuò)張，以判斷多態(tài)性DNA的結(jié)合位點(diǎn)，以判斷該區(qū)域序列發(fā)生基因突變、片段插入、缺失情況引發(fā)的分子量變化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)DNA片段[15]。通過對(duì)同屬不同種種子果實(shí)類中藥根尖體染色體、蛋白質(zhì)DNA條形碼特征研究，結(jié)果說明混淆品和正品存在特征區(qū)別。通過DNA技術(shù)鑒別不同種種子果實(shí)類中藥提供了理論依據(jù)，同時(shí)建立了動(dòng)植物關(guān)系為分類學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。通過中藥基原鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)，研發(fā)便攜式設(shè)備，使DNA條形碼鑒定技術(shù)得到普及擴(kuò)大使用范圍。DNA條形碼技術(shù)可與更多的科學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用，以改善應(yīng)用的不足和局限性，有效促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化及規(guī)?；?/p>