角膜上皮基底神經(jīng)叢結(jié)構(gòu)拼圖法對全視網(wǎng)膜光凝后糖尿病患者角膜神經(jīng)損傷的評估

黃淑蘭 趙少貞 王效武 楊紀(jì)忠 鄭曉汾 韓玉萍 趙炬?zhèn)?侯廣平 于花

1天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室 300384；2山西省眼科醫(yī)院，太原 030002

糖尿病是臨床常見的慢性代謝性疾病，可引起全身多種組織器官的損害，在中國的患病率約為11.6%[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，其在糖尿病人群中的患病率高達23%[2]。全視網(wǎng)膜光凝術(shù)(panretinal photocoagulation，PRP)可有效阻止DR的進展[3]。但是，PRP在發(fā)揮治療作用的同時也會對眼組織的正常結(jié)構(gòu)和功能造成一定影響，如局部熱量擴散導(dǎo)致Bruch膜破裂、脈絡(luò)膜和神經(jīng)纖維層損傷[4-5]。近年來，PRP對眼前節(jié)的影響也日益受到關(guān)注。研究表明,氬激光光凝會明顯加重增生期DR患者的角膜神經(jīng)損傷[6]。但也有研究發(fā)現(xiàn)PRP治療后6個月和未接受PRP治療的增生期DR患者角膜中央?yún)^(qū)角膜上皮基底神經(jīng)叢(subbasal nerve plexus，SNP)密度并無明顯差異[7]。角膜激光掃描共焦顯微鏡(corneal confocal laser scanning microscopy，CCM)是活體角膜神經(jīng)檢測的主要手段。CCM觀察視野小且缺乏定位功能，不能保證對同一部位進行重復(fù)檢查，由此獲得的神經(jīng)參數(shù)具有高度不確定性。因此需設(shè)立CCM檢查的定位標(biāo)志，以保證縱向研究中圖像采集的一致性。SNP神經(jīng)纖維呈放射狀向中央聚集，最終在角膜頂點鼻下方1～2 mm處聚集形成一個旋渦狀集合，稱為渦狀結(jié)構(gòu)[8]。這一結(jié)構(gòu)形態(tài)特殊，容易辨識，可能成為CCM檢查的理想定位標(biāo)志[9]。Edwards等[10]以渦狀結(jié)構(gòu)為起始和終止的標(biāo)志設(shè)計了CCM圖像采集流程，并利用計算機軟件將檢查得到的單張圖像拼接合成大范圍的SNP結(jié)構(gòu)拼圖，在此基礎(chǔ)上再進行參數(shù)分析。這種方法不僅擴大了觀察視野，使研究者獲得更多的形態(tài)學(xué)信息，而且可針對同一區(qū)域進行重復(fù)測量，使神經(jīng)參數(shù)分析具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[11]，從而有效克服了CCM檢查設(shè)備的局限性。本研究擬采用SNP結(jié)構(gòu)拼圖法觀察PRP治療前后SNP的變化并探討其發(fā)病機制，為PRP治療過程中角膜神經(jīng)損傷的臨床預(yù)防和治療相關(guān)眼表病變提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用隨機對照研究方法，納入2019年4—11月在山西省眼科醫(yī)院就診、經(jīng)熒光素眼底血管造影確診為2型糖尿病合并雙眼DR Ⅳ期的患者57例114眼，其中男24例48眼，女33例66眼。采用隨機數(shù)字表法將患者分為水平-垂直激光組和垂直-水平激光組。水平-垂直激光組29例58眼，其中男11例22眼，女18例36眼；平均年齡(55.01±4.49)歲；平均糖尿病病程(12.92±2.80)年。垂直-水平激光組28例56眼，其中男13例26眼，女15例30眼；平均年齡(54.94±4.15)歲；平均糖尿病病程(12.74±2.67)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)雙眼眼底病變符合DR Ⅳ期診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，即在非增生期DR，如微動脈瘤、視網(wǎng)膜硬性滲出、出血和棉絨斑的基礎(chǔ)上出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管或視盤新生血管；(2)年齡50～65歲；(3)經(jīng)內(nèi)分泌科確診為2型糖尿病，且病程為10～15年；(4)糖化血紅蛋白水平為6.5%～7.0%；(5)對數(shù)視力表單眼視力>0.1；(6)眼壓正常；(7)眼表無明顯炎癥表現(xiàn)，角膜光滑、透明；(8)同意接受檢查并能按時完成隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因瞳孔過小或玻璃體積血無法完成PRP者；(2)合并黃斑水腫或新生血管性青光眼者；(3)合并其他眼底血管性疾病或先天異常者；(4)有眼外傷、眼部手術(shù)及激光治療史者；(5)有干眼、角膜斑翳、翼狀胬肉、圓錐角膜、高度近視、變應(yīng)性結(jié)膜炎、感染性角結(jié)膜炎、葡萄膜炎、青光眼或眼部持續(xù)用藥史者；(6)有角膜接觸鏡佩戴史者；(7)有除糖尿病以外的其他影響神經(jīng)功能的系統(tǒng)性疾病和相關(guān)治療史者；(8)1型糖尿病或其他特殊類型的糖尿病患者；(9)糖尿病合并酮癥酸中毒或高滲綜合征患者；(10)有結(jié)締組織病者；(11)有慢性肝臟或腎臟疾病者；(12)PRP或隨訪期間接受抗血管內(nèi)皮生長因子藥物或內(nèi)眼手術(shù)治療者：(13)隨訪期間需要補充激光治療者。2個組患者各基線特征比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表1)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)山西省眼科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(批文號：201804b)，所有受檢者對本研究目的和方法知情并自愿參加本研究，所有受檢者均簽署知情同意書。

表1 2個組受檢者基線特征比較Table 1 Comparison of the baseline characteristics betweenthe two groups組別例數(shù)性別(男/女)a年齡(mean±SD,歲)b糖尿病病程(mean±SD,年)b水平-垂直激光組2911/1855.01±4.4912.92±2.80垂直-水平激光組2813/1554.94±4.1512.74±2.67t/χ2值0.6160.0580.281P值0.4330.9510.780 (a:χ2檢驗;b:獨立樣本t檢驗) (a:χ2 test;b:Independent samples t-test)

1.2 方法

1.2.1眼科檢查 分別于PRP治療前，治療1周(第1次光凝后1周)、2周(第2次光凝后1周)、3周(第3次光凝后1周)、4周(第4次光凝后1周)和PRP完成后1個月行裂隙燈顯微鏡(SLM-8E，重慶康華瑞明科技股份有限公司)檢查、裂隙燈顯微鏡下前置鏡檢查和非接觸性眼壓計(CT-80A，日本Topcon公司)測量，明確患者眼表是否有明顯炎癥，角膜是否存在斑翳、新生血管、增生物以及上皮是否完整，虹膜是否紅變，前房是否存在炎癥反應(yīng)等，眼壓是否正常以及眼底是否符合DR Ⅳ期表現(xiàn)，激光后是否有玻璃體積血等并發(fā)癥。由同一位經(jīng)驗豐富醫(yī)生采用頻域光相干斷層掃描儀(Spectralis OCT Blue Peak，德國海德堡工程有限公司)行熒光素眼底血管造影以評估雙眼DR病情，視網(wǎng)膜無灌注區(qū)面積越大、新生血管數(shù)量越多或出現(xiàn)視盤新生血管，則說明病情越重。

1.2.2PRP治療 根據(jù)熒光素眼底血管造影結(jié)果選擇患者DR病情較重眼作為治療眼，對側(cè)眼作為對照眼。治療眼治療前采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液[參天制藥(中國)有限公司]點眼以充分?jǐn)U瞳，采用鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康公司比利時分公司)點眼2次行表面麻醉。由同一位經(jīng)驗豐富的醫(yī)生采用SupraScan 577多點掃描激光器(法國光太醫(yī)療公司)分4次完成標(biāo)準(zhǔn)PRP，每次間隔1周。水平-垂直激光組在行PRP治療時先行水平子午線方向的視網(wǎng)膜光凝，光凝順序為顳側(cè)-鼻側(cè)-下方-上方；垂直-水平激光組先行垂直子午線方向視網(wǎng)膜光凝，光凝順序為下方-上方-顳側(cè)-鼻側(cè)。光凝采用方形矩陣模式，周邊視網(wǎng)膜因弧度變化導(dǎo)致聚焦困難或鄰近大血管處給予單點模式補充治療。每次視網(wǎng)膜光凝光斑數(shù)為600～800個，療程結(jié)束時，光斑總數(shù)達到2 500～3 000個。激光參數(shù)：光斑直徑100～300 μm；功率100～200 mW；曝光時間0.05 s；光斑間隔1/2光斑直徑；光凝強度達到Tso分級Ⅲ級輕～中度光斑反應(yīng)。每次激光結(jié)束后均采用普拉洛芬滴眼液(山東海山藥業(yè)有限公司)點眼，4次/d，持續(xù)1個月。

1.2.3疼痛程度評估 每次視網(wǎng)膜光凝后采用簡式McGill疼痛問卷[13]對患者進行問卷調(diào)查并評分，內(nèi)容包括疼痛分級指數(shù)、現(xiàn)時疼痛強度和視覺模擬評分。疼痛分級指數(shù)包含11個感覺項和4個情緒項，結(jié)果分為無、輕、中、重4項，分別計為0、1、2、3分；現(xiàn)時疼痛強度分為無痛、輕度不適、不適、難受、可怕的痛和極為痛苦6項，分別計為0、1、2、3、4、5分，評估時根據(jù)患者主觀感受在相應(yīng)分值上作記號；視覺模擬評分是使用1把長10 cm的標(biāo)尺，0～10 cm相應(yīng)地記為0～10分，0分表示無痛，10分代表難以忍受的劇烈疼痛或難受至想要摘除眼球的程度。評分時在標(biāo)尺上用筆標(biāo)出能代表自己發(fā)作時疼痛或難受程度的相應(yīng)位置，醫(yī)生根據(jù)患者標(biāo)出的位置評估分?jǐn)?shù)。總分為3種評分之和，評分越高表示疼痛越嚴(yán)重。每例患者共完成4次調(diào)查問卷，取平均值及重復(fù)率高者作為該患者的最終調(diào)查結(jié)果。

1.2.4CCM檢查及局部神經(jīng)形態(tài)圖像的獲取 采用海德堡Ⅱ代激光斷層掃描系統(tǒng)(HRT-Ⅱ，德國海德堡工程有限公司)的Rostock角膜模塊進行CCM檢查。角膜接觸帽與鏡頭之間的耦合劑為卡波姆滴眼液(美國博士倫公司)。檢查前用鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康公司比利時分公司)點眼行表面麻醉。掃描深度定位到SNP層后，首先查找渦狀結(jié)構(gòu)，然后以該結(jié)構(gòu)為中心以“回”字形方式向外移動物鏡擴展檢查范圍，使用“section”模式快速采集渦狀區(qū)及其周圍2～3 mm范圍的SNP圖像。去除不聚焦或神經(jīng)結(jié)構(gòu)不全的圖像，可以得到200～400張SNP圖像。將圖像在Photoshop CC 2017圖像處理軟件(美國奧多比系統(tǒng)公司)中載入堆棧，手動把具有重復(fù)區(qū)域的單張圖像拼接合成局部神經(jīng)形態(tài)圖。拼接完成后由完成CCM檢查的醫(yī)生檢查拼圖的準(zhǔn)確性，并糾正原始拼接處的圖像錯位或神經(jīng)缺失。以渦狀結(jié)構(gòu)為中心裁剪700 μm×700 μm大小的圖片，采用ImageJ軟件的Neuron J插件進行神經(jīng)參數(shù)定量分析，計算單位面積的神經(jīng)纖維長度(nerve fiber length，NFL)。

1.2.5評估指標(biāo) 主要評估指標(biāo)為不同眼別及不同光凝順序組間不同觀察時間點SNP的NFL變化；次要評估指標(biāo)為PRP后治療眼的疼痛程度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示；計數(shù)資料以頻數(shù)表示。水平-垂直激光組與垂直-水平激光組間患者年齡和糖尿病病程差異比較采用獨立樣本t檢驗，組間性別構(gòu)成差異比較采用χ2檢驗；治療眼和對照眼及不同激光組各時間點NFL總體差異比較均采用重復(fù)測量兩因素方差分析，組內(nèi)多重比較采用Tukey檢驗，同一時間點治療眼和對照眼或不同組間NFL比較采用配對t檢驗。采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療眼和對照眼各觀察時間點SNP比較

在PRP治療眼中，接受PRP治療后出現(xiàn)不同程度SNP神經(jīng)結(jié)構(gòu)缺失的神經(jīng)損傷表現(xiàn)者11眼，以顳側(cè)多見，其次為鼻側(cè)；對照眼SNP神經(jīng)纖維未觀察到明顯變化。不同觀察時間點治療眼與對照眼NFL總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F眼別=2.020，P=0.039；F時間=4.062，P=0.001)；治療眼PRP治療1、2、3、4周時NFL均明顯低于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，PRP治療后1個月NFL低于PRP前，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照眼各觀察時間點NFL與治療前比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。治療眼與對照眼PRP治療前NFL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.991)；PRP治療1、3、4周治療眼NFL均低于對照眼，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；治療眼PRP治療2周和治療后1個月NFL均低于對照眼，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。

2.2 不同光凝順序組間SNP損傷情況比較

水平-垂直激光組治療眼第1次光凝(顳側(cè)光凝)后出現(xiàn)顳側(cè)SNP神經(jīng)纖維部分或全部缺失者6例6眼，第2次光凝(鼻側(cè)光凝)后出現(xiàn)鼻側(cè)SNP神經(jīng)纖維缺失者1例1眼；垂直-水平激光組治療眼第3次光凝(顳側(cè)光凝)后出現(xiàn)SNP顳側(cè)神經(jīng)纖維部分或全部缺失者3例3眼(圖1)，第4次光凝(鼻側(cè)光凝)后出現(xiàn)鼻側(cè)SNP神經(jīng)纖維缺失者1例1眼。2個組間治療眼NFL值總體比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F分組=0.099，P=0.754)，但治療前后不同時間點NFL總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=5.231，P<0.001)。水平-垂直激光組PRP治療1周、2周以及PRP治療后1個月NFL均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，垂直-水平激光組治療前后不同時間點間NFL比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；水平-垂直激光組與垂直-水平激光組PRP治療前NFL比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.994)；PRP治療1周、2周時水平-垂直激光組NFL均低于垂直-水平激光組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；PRP治療3周、4周以及治療后1個月水平-垂直激光組與垂直-水平激光組NFL比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。

圖1 垂直-水平激光組治療眼治療前后不同時間點渦狀區(qū)CCM圖像(×800，觀察視野1.0 mm×1.0 mm) 可見在第3次光凝后治療眼出現(xiàn)顳側(cè)神經(jīng)纖維缺失 A：治療前 B：治療1周 C：治療2周 D：治療3周 E：治療4周 F：治療后1個月Figure 1 CCM images of the whorl-like region at various time points in the vertical-horizontal laser group (×800,view field:1.0 mm×1.0 mm) The loss of the temporal nerve fiber was found after the third photocoagulation A:Before treatment B:One week after the first PRP C:One week after the second PRP D:One week after the third PRP E:One week after the fourth PRP F:One month after PRP treatment

表3 不同光凝順序組治療眼不同時間點NFL比較(mean±SD,mm/mm2)Table 3 Comparison of NFL at various time points between the two groups(mean±SD,mm/mm2)組別眼數(shù)不同時間點NFL治療前治療1周治療2周治療3周治療4周治療后1個月垂直-水平激光組2815.00±3.7514.69±3.6514.89±3.6514.31±3.4314.34±3.6614.79±3.55水平-垂直激光組2915.53±3.2513.87±2.98ab14.02±3.26ab14.38±3.1814.32±3.0114.30±3.31a 注:F組別=0.099,P=0.754;F時間=5.231,P<0.001;F交互作用=2.894,P=0.015.與治療前NFL比較,aP<0.05;與各時間點垂直-水平激光組NFL比較,bP<0.05(重復(fù)測量兩因素方差分析,Tukey檢驗) NFL:神經(jīng)纖維長度 Note:Fgroup=0.099,P=0.754;Ftime=5.231,P<0.001;Finteraction=2.894,P=0.015.Compared with respective pre-treatment NFL,aP<0.05;compared with NFL of the vertical-horizontal laser group at corresponding time points,bP<0.05 (Repeated measurement two-way ANOVA,Tukey test) NFL:nerve fiber length

2.3 PRP后治療眼疼痛程度比較

簡式McGill疼痛問卷調(diào)查顯示，PRP后出現(xiàn)疼痛者9例9眼，總疼痛評分為6.78±2.73，其中7例7眼第1次光凝后出現(xiàn)疼痛。

3 討論

DM患者的角膜被稱為“高危角膜”，對外界侵襲的抵抗能力明顯低于正常人[14]。Ozdemir等[15]研究認為，PRP是2型糖尿病患者眼表異常的高危因素。Neira-Zalentein等[16]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者行PRP治療后角膜知覺明顯減退。角膜知覺是神經(jīng)功能的重要體現(xiàn)，推測PRP可能會造成角膜神經(jīng)損傷，但是由于活體角膜神經(jīng)檢測手段的局限性，目前國內(nèi)外關(guān)于PRP對角膜神經(jīng)的影響尚未達成共識[6-7]。本研究采用先進的拼圖技術(shù)，借助SNP結(jié)構(gòu)拼圖良好的圖像再現(xiàn)性和穩(wěn)定性對角膜神經(jīng)參數(shù)進行評估，發(fā)現(xiàn)PRP治療后部分患者出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)損傷，且治療后NFL均較治療前下降，這一結(jié)果證實PRP可以導(dǎo)致DM患者角膜神經(jīng)損傷。

目前PRP導(dǎo)致角膜神經(jīng)損傷的確切機制尚未完全闡明，多數(shù)研究者推測可能與激光對睫狀后長神經(jīng)的熱損傷有關(guān)。角膜的感覺神經(jīng)起源于睫狀后長神經(jīng)，其在眼底位于水平子午線附近，形如面條狀，呈黃白色或杏黃色，大多數(shù)在赤道稍后處即可分辨，前至鋸齒緣。早在20世紀(jì)80年代即有視網(wǎng)膜光凝后患者出現(xiàn)調(diào)節(jié)功能障礙和瞳孔對光反應(yīng)異常的報道[17-20]。龔頌建[21]也曾報道了2例患者接受半導(dǎo)體激光視網(wǎng)膜光凝后出現(xiàn)瞳孔散大、對光反射消失和角膜上皮糜爛，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)多診斷為睫狀神經(jīng)損傷。但是，該研究只是根據(jù)臨床體征進行的推斷，并沒有睫狀神經(jīng)損傷的直接證據(jù)，并且視網(wǎng)膜光凝采用的是氬離子或者半導(dǎo)體激光器，易產(chǎn)生熱效應(yīng)損傷。由于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜對氬激光具有較高的吸收率，因此氬離子激光器容易產(chǎn)生過多的光熱效應(yīng)；而半導(dǎo)體激光器輸出的是810 nm的長波長激光，作用部位可深達脈絡(luò)膜層[22]。因此，這2種激光的熱效應(yīng)比較容易透過脈絡(luò)膜而刺激位于脈絡(luò)膜上腔的睫狀后長神經(jīng)。隨著激光技術(shù)的改進，目前臨床上治療DR常用577 nm的黃色激光，這種激光被認為是PRP治療中的理想波長，國內(nèi)外尚缺乏577 nm黃色激光對角膜神經(jīng)影響的報道。本研究根據(jù)睫狀后長神經(jīng)在眼底的分布位置調(diào)整光凝順序，分別觀察了水平徑線光凝和垂直徑線光凝時SNP的改變，發(fā)現(xiàn)577 nm黃色激光在進行水平徑線光凝時部分患者光凝側(cè)SNP神經(jīng)纖維部分或全部缺失，NFL明顯下降；但在進行垂直方向光凝時并未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)纖維缺失。這一結(jié)果間接說明577 nm黃色激光在進行水平徑線光凝時也可以通過熱傳導(dǎo)損傷睫狀后長神經(jīng)，進而影響角膜SNP。

以往還有研究發(fā)現(xiàn)顳側(cè)和鼻側(cè)周邊視網(wǎng)膜光凝時患者容易出現(xiàn)疼痛，認為與睫狀后長神經(jīng)的分布有關(guān)[23]。然而在本研究中，疼痛發(fā)生的時間以第1次光凝時多見，并未發(fā)現(xiàn)疼痛與視網(wǎng)膜的光凝部位有明顯關(guān)系，考慮造成此差異的原因除了與患者情緒、心理素質(zhì)以及治療過程中的配合程度等因素有關(guān)外，還可能與激光波長和光凝模式的選擇有關(guān)。

綜上所述，本研究通過拼圖技術(shù)證實了PRP可以導(dǎo)致DR患者角膜神經(jīng)損傷，并且根據(jù)睫狀后長神經(jīng)在眼底的分布位置進一步調(diào)整光凝順序，分別觀察了水平徑線光凝和垂直徑線光凝時SNP的改變，驗證了PRP通過熱傳導(dǎo)損傷睫狀后長神經(jīng)，進而影響角膜SNP的理論。本研究結(jié)果提示我們在進行水平子午線方向的視網(wǎng)膜光凝時應(yīng)當(dāng)注意避開睫狀后長神經(jīng)，在對其周圍視網(wǎng)膜進行光凝時也應(yīng)適當(dāng)調(diào)整激光能量，盡量避免損傷睫狀后長神經(jīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明黃淑蘭：參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，起草文章，根據(jù)編輯部的修改意見進行論文修改；趙少貞：指導(dǎo)選題、設(shè)計，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；王效武、楊紀(jì)忠、鄭曉汾、韓玉萍：技術(shù)或材料支持，資料的分析和解釋；趙炬?zhèn)?、侯廣平：實施研究；于花：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果和結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進行論文修改