芹菜素對子宮內膜癌HEC-1-B細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究

陳容，時艷華

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是常見的婦科惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經期和絕經后女性，EC的發(fā)病率與患者的生活習慣和區(qū)域密切相關，呈逐年增高趨勢［1］。手術、放化療等傳統(tǒng)的治療手段效果顯著，但會產生肝腎損傷、胃腸道毒性、月經不調等不良反應［2］。目前，中醫(yī)藥治療腫瘤日益受到臨床的關注，中藥在發(fā)揮多途徑、多靶點治療的同時，還具備不良反應少、機體耐受性好等優(yōu)勢［3］。芹菜素是一種天然的黃酮類化合物，目前已證實其具有抗炎、抗氧化和調節(jié)免疫等生物活性［4-5］。還能抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括乳腺癌［6］、黑色素瘤［7］、多發(fā)性骨髓瘤［8］、肝癌［9］等。然而，芹菜素對EC生物學功能的影響鮮見報道。本研究通過觀察芹菜素對人子宮內膜癌HEC-1-B細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等生物學功能的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 HEC-1-B細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。芹菜素購自武漢艾美捷科技有限公司，胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B購自美國Gibco公司，Annexin V-FITC∕PI凋亡試劑盒、CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2以及磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT Serine∕Threonine Kinase，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)箱（MCO-18AC）購自日本三洋公司，流式細胞分析儀（CytoFLEX）購自美國貝克曼公司，凝膠成像儀（Gel Doc XR）購自美國伯樂公司，低溫高速冷凍離心機（H2500R-2）購自湖南湘儀離心機有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) HEC-1-B細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1 mmol∕L谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至融合度達到80%～90%時進行傳代處理，取生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8法測定細胞增殖能力 取處于對數生長期的HEC-1-B細胞，接種到96孔板中，每孔約5×103個細胞，待細胞貼壁生長穩(wěn)定后進行給藥處理。將芹菜素溶于DMSO，配制成50 mmol∕L的母液，實驗組芹菜素濃度分別為0、20、40和80μmol∕L。將母液用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，每個濃度設置12個復孔，分別在細胞培養(yǎng)24、48和72 h后每孔加入10μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。然后，在450 nm的波長下測定各孔的光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗孔OD值∕對照孔OD值）×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的HEC-1-B細胞，以1×106∕孔接種至6孔板。待細胞貼壁且生長穩(wěn)定，向孔中分別加入20、40和80μmol∕L的芹菜素，并設置空白對照組。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)上清液，收集細胞。按照Annexin V-FITC∕PI凋亡試劑盒操作說明處理細胞，流式細胞儀檢測不同濃度芹菜素處理后HEC-1-B細胞的凋亡情況。

1.5 Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力 取處于生長對數期的HEC-1-B細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基將細胞稀釋至5×105個∕mL，取100μL細胞懸液加入Transwell小室的上室（其中侵襲實驗預先在上室中加入100μL基質膠，遷移實驗不需要加入基質膠），將Transwell小室置于24孔板中，并向下室中加入600μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)1 h后，用RPMI 1640培養(yǎng)基分別將芹菜素母液稀釋至0、5、10、20μmol∕L，隨后替換下層培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室。用4%的多聚甲醛在4℃固定15 min，0.1%結晶紫室溫染色20 min。最后用脫脂棉球輕輕擦去Transwell上室中未發(fā)生侵襲和遷移的細胞，晾干后在顯微鏡下拍照，并計算細胞侵襲和遷移數量。

1.6 Western blot檢測芹菜素對凋亡相關蛋白和PI3K∕AKT通路蛋白表達的影響 收集0、20、40、80μmol∕L芹菜素處理后的HEC-1-B細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解30 min，之后4℃、12000 r∕min離心15 min，吸取上清液。BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，經轉膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯影等步驟后，用Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度值分析，計算相對表達量。實驗中Bax、Bcl-2、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、GAPDH一抗稀釋比例均為1∶1000，二抗稀釋比例均為1∶8000。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有數據采用GraphPad Prism 8.1進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芹菜素對HEC-1-B細胞增殖能力的影響 20～80μmol∕L范圍內，隨著芹菜素濃度的升高和處理時間的延長，芹菜素對HEC-1-B細胞增殖的抑制作用越來越明顯，見表1。

Tab.1 Comparison of inhibition rates of cell proliferation after apigenin treatment between three groups表1 芹菜素處理后各組細胞增殖抑制率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Comparison of inhibition rates of cell proliferation after apigenin treatment between three groups表1 芹菜素處理后各組細胞增殖抑制率比較（n=3，%，±s）

**P＜0.01；a與20μmol∕L組比較，b與40μmol∕L組比較，P＜0.05；組內比較：A與處理24 h比較，B與處理48 h比較

組別20μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組F 24 h 16.64±1.0548.71±1.46a 69.11±3.47ab 411.900**48 h 31.45±2.89A 61.87±3.32aA 79.90±0.67abA 271.50**72 h 46.25±5.13AB 70.17±6.44aAB 89.55±0.88abAB 61.720**F 55.030**19.300**70.820**

2.2 4組細胞凋亡水平比較 0、20、40和80μmol∕L的芹菜素處理HEC-1-B細胞后，細胞凋亡率（%）分別為6.21±0.94、13.51±1.69、21.87±1.06、30.24±2.34，隨著芹菜素濃度的升高，細胞凋亡率逐漸增高（F=125.200，P＜0.05），組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.3 4組細胞凋亡相關蛋白表達水平的變化 0～80μmol∕L范圍內，隨著芹菜素濃度的升高，促凋亡蛋白Bax表達逐漸增高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達逐漸下降。見圖2，表2。

Fig.2 Effects of apigenin on apoptosis related proteins圖2 芹菜素對凋亡相關蛋白的影響

Fig.3 Transwell test showed that apigenin inhibited the invasion and migration of HEC-1-B cells(×100)圖3 Transwell實驗驗證芹菜素抑制HEC-1-B細胞的侵襲和遷移（×100）

Tab.2 The expression levels of apoptosis related proteins of HEC-1-B cells in three groups表2 各組HEC-1-B細胞凋亡相關蛋白的表達水平（n=3，±s）

Tab.2 The expression levels of apoptosis related proteins of HEC-1-B cells in three groups表2 各組HEC-1-B細胞凋亡相關蛋白的表達水平（n=3，±s）

**P＜0.01，a與0μmol∕L組比較，b與20μmol∕L組比較，c與40μmol∕L組比較，P＜0.05

組別0μmol∕L組20μmol∕L組40μmol∕L組80μmol∕L組F Bcl-20.48±0.030.34±0.03a 0.22±0.04ab 0.12±0.03abc 65.530**Bax 0.15±0.040.28±0.03a 0.40±0.02ab 0.72±0.03abc 207.900**

2.4 芹菜素抑制HEC-1-B細胞的遷移和侵襲 經0、5、10和20μmol∕L的芹菜素處理后，細胞的遷移和侵襲數量逐漸較少，見圖3，表3。

Tab.3 Effects of apigenin at different concentrations on migration and invasion of HEC-1-B cells表3 不同濃度芹菜素處理后HEC-1-B細胞遷移和侵襲能力比較（n=3，個∕視野，±s）

Tab.3 Effects of apigenin at different concentrations on migration and invasion of HEC-1-B cells表3 不同濃度芹菜素處理后HEC-1-B細胞遷移和侵襲能力比較（n=3，個∕視野，±s）

**P＜0.01，a與0μmol∕L組比較，b與5μmol∕L組比較，c與10μmol∕L組比較，P＜0.05

組別0μmol∕L組5μmol∕L組10μmol∕L組20μmol∕L組F細胞侵襲81.66±4.9053.15±2.28a 36.33±4.38ab 16.08±3.59abc 169.100**細胞遷移104.61±6.0785.46±8.73a 48.51±4.66ab 23.28±3.21abc 110.300**

2.5 芹菜素抑制HEC-1-B細胞內PI3K∕AKT信號通路的激活 40μmol∕L芹菜素處理HEC-1-B細胞24 h后，與0μmol∕L組相比，p-PI3K和p-AKT的蛋白表達水平均降低（均P＜0.01）。見圖4，表4。

Fig.4 The expression of PI3K∕AKT pathway proteins detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測芹菜素作用后PI3K∕AKT通路蛋白的表達變化

Tab.4 The expression levels of PI3K/Akt pathway proteins after treatment with 0μmol/L and 40μmol/L apigenin表4 0μmol/L和40μmol/L芹菜素作用后PI3K/AKT相關通路蛋白的表達水平變化 （n=3，±s）

Tab.4 The expression levels of PI3K/Akt pathway proteins after treatment with 0μmol/L and 40μmol/L apigenin表4 0μmol/L和40μmol/L芹菜素作用后PI3K/AKT相關通路蛋白的表達水平變化 （n=3，±s）

**P＜0.01

組別0μmol∕L組40μmol∕L組t p-AKT 0.33±0.050.15±0.015.342**AKT 0.48±0.040.46±0.040.612 p-PI3K 0.84±0.050.42±0.0312.510**PI3K 0.67±0.020.72±0.041.936

3 討論

EC是僅次于宮頸癌的女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性的健康［10］。目前臨床上用于治療EC的藥物主要有阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑或卡鉑等，但以上藥物毒性較大，并且患者久用易出現化療耐藥，使治療失敗的風險大大增加。因此，急需尋找和研發(fā)高效低毒、價格低廉的可替代藥物。

芹菜素是廣泛存在于果蔬中的天然化合物分子，在抑制腫瘤、炎癥等方面作用顯著［11］。本實驗探索了芹菜素在抑制EC進展中的生物學功能，結果顯示，芹菜素在體外能夠抑制HEC-1-B細胞的增殖、遷移、侵襲且促進其凋亡，同時下調HEC-1-B細胞內p-AKT和p-PI3K蛋白的表達水平，這些結果表明芹菜素可能通過抑制PI3K∕AKT信號通路的激活進而抑制HEC-1-B細胞的增殖、遷移和侵襲，該研究結果與預期基本一致。本研究進一步豐富了芹菜素的抗腫瘤功能，同時也為后期芹菜素應用于臨床治療EC奠定了一定的理論基礎。

在細胞受到死亡信號刺激時，促凋亡蛋白Bax在蛋白酶的作用下發(fā)生構象變化，引起細胞器功能喪失和促凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2則在Bax誘導凋亡過程中對其功能進行抑制［12］。研究表明，20μmol∕L的芹菜素能夠抑制肝癌細胞Huh7和Hep3B的增殖，促進其凋亡［13］，并干擾肝癌細胞的信號傳導［14］。10μmol∕L的芹菜素能夠顯著抑制血管內皮生長因子的表達和腫瘤誘導的血管生成［15］。本研究結果顯示，在0～80μmol∕L范圍內，隨著芹菜素處理濃度的不斷提高，促凋亡蛋白Bax的表達量逐漸增加，而抗凋亡蛋白的Bcl-2的表達量不斷降低，說明芹菜素能夠促進HEC-1-B細胞的凋亡。這一作用同樣也體現在肺癌［16］和結腸癌［17］等腫瘤中，進一步證實了芹菜素的抗腫瘤功能。PI3K∕AKT信號通路作為細胞內重要的信號轉導通路，參與多種生物學過程的調控。磷酸化的PI3K可以產生第二信使三磷酸肌醇，進一步使AKT的氨基酸殘基發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮抑制細胞凋亡和促進細胞增殖的作用。研究表明，芹菜素能通過PI3K∕AKT信號通路抑制宮頸癌細胞的遷移并促進其凋亡［18］。筆者推測在EC中芹菜素可能通過PI3K∕AKT信號通路發(fā)揮類似作用。進一步研究發(fā)現，芹菜素能夠顯著抑制p-PI3K和p-AKT的表達水平，提示在芹菜素的作用下，PI3K∕AKT信號通路在一定程度上被阻斷，進而導致細胞增殖抑制，從而促進凋亡。

綜上所述，芹菜素能夠抑制HEC-1-B細胞的增殖、遷移、侵襲，同時誘導凋亡相關蛋白表達并促進其凋亡，其機制可能與芹菜素能夠抑制PI3K∕AKT信號通路有關。