不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激的影響

侯媛媛 閆文升* 李增明 宋磊剛 趙瑋琳 彭子富

(1.河北體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教研室 河北石家莊 050041;2.天津體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)生理與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 301617)

運(yùn)動(dòng)員的血清睪酮水平是反映其運(yùn)動(dòng)能力、肌肉力量、疲勞消除等的重要指標(biāo)之一，所以血清睪酮已成為運(yùn)動(dòng)員身體機(jī)能評(píng)定中最常用、最成熟的內(nèi)分泌指標(biāo)［1］。運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度等諸多因素影響血清睪酮的含量［2］。缺乏運(yùn)動(dòng)及超負(fù)荷的體力勞動(dòng)均可造成體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和自由基的生成增加，自由基生成率大于機(jī)體的清除能力，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、線(xiàn)粒體和細(xì)胞器受損，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常，并且可導(dǎo)致肌肉收縮功能障礙，造成肌肉損傷［3］。而一定時(shí)間和強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，能使機(jī)體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生適應(yīng)性變化，提高機(jī)體抗氧化酶活性，氧化和抗氧化系統(tǒng)之間保持平衡［4］。

目前，關(guān)于不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的血睪酮含量、骨骼肌氧化應(yīng)激水平及抗氧化酶基因表達(dá)情況如何，以及相應(yīng)的骨骼肌形態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)，有待進(jìn)一步研究明確。該實(shí)驗(yàn)以成年雄性SD 大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，4 周不同強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練為運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案，觀察不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)血清睪酮水平、骨骼肌自由基代謝、抗氧化酶活性和基因表達(dá)及形態(tài)學(xué)的影響，以期探索出適宜運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，防止骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷，達(dá)到最佳運(yùn)動(dòng)效果，為科學(xué)制定運(yùn)動(dòng)處方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32 只成年雄性SD 大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)溫度控制在（22±2）℃，12h亮黑循環(huán)（06：00～18：00 照明），食物和水供給充足。所有大鼠在動(dòng)物室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù)方式

建立不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠模型［5］，分為安靜組、小強(qiáng)度組、中強(qiáng)度組和大強(qiáng)度組，每組8只，共32只，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)4周。小強(qiáng)度組：第1周10min/天（10m/min），第2～4周20min/天（15m/min）；中強(qiáng)度組：第1 周30min/天（10m/min），第2～4周60min/天（15m/min）；大強(qiáng)度組：第1周60min/天（10m/min），第2～4周120min/天（15m/min）。安靜組：進(jìn)行必要的鼠籠清潔，其他不做任何干預(yù)。

1.2.2 測(cè)試樣品制備

整個(gè)運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后取材，直接斷頭取血，將血液于室溫靜置30min，于低溫離心機(jī)中（3000r/min）離心15min，取血清用于睪酮水平測(cè)定。同時(shí)，分離右側(cè)比目魚(yú)?。ㄍ晃恢茫?，預(yù)冷PBS緩沖液沖洗表面血液，錫箔紙包裹、標(biāo)記后于液氮保存用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)。另取新鮮比目魚(yú)肌組織制備成10%的組織勻漿，以3000r/min 的速度，離心15min 取上清，用于骨骼肌抗氧化劑Mn-SOD、GSH-PX及脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA水平的檢測(cè)。取左側(cè)比目魚(yú)肌樣本，HE染色樣品制備，室溫保存。

1.2.3 血清睪酮濃度檢測(cè)

以放射免疫分析法檢測(cè)血清睪酮的含量。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照碘（125I）睪酮放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 骨骼肌組織切片及蘇木精-伊紅染色

完成固定后的標(biāo)本依次進(jìn)行脫水-透明-浸蠟-包埋。取樣本切片，切片厚度4μm，行蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin Staining，HE 染色）。Leica 倒置光學(xué)顯微鏡觀察（Leica Co，Germany），選取視野進(jìn)行觀察拍照，觀察形態(tài)學(xué)變化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.5 骨骼肌Mn-SOD、GSH-PX及MDA水平檢測(cè)

Mn-SOD測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，GSH-PX測(cè)定采用比色法測(cè)定，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法。檢測(cè)嚴(yán)格按照測(cè)試盒的操作程序進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 qPCR檢測(cè)

提取比目魚(yú)肌組織總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min，95℃變性10s，退火/延伸72℃20s，共40 個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算Mn-SOD 和GSHPX mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：Mn-SOD（5′-ACAACTCCCAGAAGCCTAAGAATG-3′and5′-GCTT TTCCCTTGGCAGCTATG-3′），GSH-PX（5′-AATCAG TTCGGACATCAGGAG-3′and5′-GAAGGTAAAGAGCG GGTGAG-3′），以GAPDH為內(nèi)參基因，GAPDH（5′-GAC TCTTACCCACGGCAAGTT-3′and5′-GGTGATGGGTTT CCCGTTGA-3′）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有參數(shù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析法（Oneway analysis of variance，one-way ANOVA），P<0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重

對(duì)實(shí)驗(yàn)前各組體重進(jìn)行分析顯示：各組動(dòng)物的體重?zé)o顯著差異。對(duì)各組動(dòng)物4周后體重增長(zhǎng)量進(jìn)行分析（見(jiàn)表1）：隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的逐漸增加，體重增長(zhǎng)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且組間存在顯著性差異（P<0.05），大強(qiáng)度組的體重增長(zhǎng)量比安靜組降低了31%，小強(qiáng)度組及中強(qiáng)度組的體重增長(zhǎng)量與安靜組相比無(wú)顯著性差異。

表1 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)前、后動(dòng)物體重測(cè)量（g）

2.2 大鼠血清睪酮水平

經(jīng)過(guò)4 周訓(xùn)練后，安靜組大鼠血清睪酮水平為439.8±36.40ng/dl，小強(qiáng)度組血清睪酮水平為465.6±39.83ng/dl，與安靜組相比無(wú)顯著差異。安靜組、中強(qiáng)度組和大強(qiáng)度組各組之間血清睪酮水平存在顯著差異，中強(qiáng)度組血清睪酮水平為770.3±43.06ng/dl，顯著高于安靜組（P<0.01）；大強(qiáng)度組血清睪酮水平為140.1±21.69ng/dl，顯著低于安靜組（P<0.01）（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)組血清睪酮水平

2.3 大鼠比目魚(yú)肌顯微結(jié)構(gòu)觀察

光鏡下觀察安靜組（見(jiàn)圖2a）及小強(qiáng)度組（見(jiàn)圖2b）比目魚(yú)肌肌束排列整齊，無(wú)淤血、無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及水腫；中強(qiáng)度組（見(jiàn)圖2c）肌束間隙增寬，肌束增粗；大強(qiáng)度組（見(jiàn)圖2d）肌束間血管擴(kuò)張、淤血，多灶性慢性炎細(xì)胞聚集，血管周?chē)匝准?xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)組比目魚(yú)肌形態(tài)學(xué)變化（HE染色，200×）

2.4 大鼠比目魚(yú)肌氧化應(yīng)激參數(shù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小強(qiáng)度組比目魚(yú)肌中的Mn-SOD和GSH-PX 活性、MDA 的量與安靜組相比，無(wú)顯著差異。安靜組、中強(qiáng)度組和大強(qiáng)度組各組之間比目魚(yú)肌的Mn-SOD（P<0.01）（見(jiàn)圖3）、GSH-PX 活性（P<0.01）（見(jiàn)圖4）和MDA的量（P<0.01）（見(jiàn)圖5）存在明顯差異。中強(qiáng)度組比目魚(yú)肌Mn-SOD 和GSH-PX 活性、MDA 的量與安靜組相比，Mn-SOD 和GSH-PX 活性顯著升高，MDA 水平降低（P<0.01）；大強(qiáng)度組比目魚(yú)肌Mn-SOD和GSH-PX活性、MDA的量與安靜組相比，Mn-SOD和GSH-PX 活性顯著降低，MDA 的量升高（P<0.01）（見(jiàn)圖3、圖4、圖5）。

圖3 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)對(duì)比目魚(yú)肌Mn-SOD的影響

圖4 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)對(duì)比目魚(yú)肌GSH-PX的影響

圖5 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)對(duì)比目魚(yú)肌MDA的影響

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小強(qiáng)度組比目魚(yú)肌中的MnSOD RNA 和GSH-PX RNA 表達(dá)與安靜組相比，無(wú)顯著差異。安靜組、中強(qiáng)度組和大強(qiáng)度組各組之間比目魚(yú)肌的Mn-SOD RNA（p<0.01）（見(jiàn)圖6）、GSH-PX RNA（P<0.01）（見(jiàn)圖7）表達(dá)存在明顯差異，中強(qiáng)度組MnSOD RNA 和GSH-PX RNA 表達(dá)均與安靜組相比顯著增加（P<0.01），大強(qiáng)度組MnSOD RNA和GSH-PX RNA表達(dá)與安靜組相比均明顯下降（P<0.01）。

圖6 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)對(duì)比目魚(yú)肌Mn-SOD基因表達(dá)的影響

圖7 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)對(duì)比目魚(yú)肌GSH-PX基因表達(dá)的影響

3 討論

該研究利用組織染色、生物化學(xué)及qPCR等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的逐漸增加，大鼠體重增長(zhǎng)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，體重降低明顯。長(zhǎng)時(shí)間中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，血清睪酮含量增加，比目魚(yú)肌肌束間隙增寬，肌束增粗，Mn-SOD、GSH-PX活性和基因表達(dá)顯著升高，MDA含量顯著下降；長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可顯著降低血清睪酮含量，比目魚(yú)肌肌束間血管擴(kuò)張淤血，多灶性慢性炎細(xì)胞聚集，血管周?chē)匝准?xì)胞浸潤(rùn)，Mn-SOD、GSH-PX活性和基因表達(dá)顯著降低，MDA 含量顯著升高；安靜組和小強(qiáng)度組比目魚(yú)肌血清睪酮、組織形態(tài)、氧化應(yīng)激參數(shù)、Mn-SOD和GSH-PX基因表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。這些研究結(jié)果表明不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可以影響骨骼肌的氧化應(yīng)激水平，影響骨骼肌的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，抗氧化的代表酶，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutases，SODs）用于專(zhuān)一清除超氧陰離子自由基（O2-），是體內(nèi)對(duì)抗自由基的第一道防線(xiàn)，其中錳超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，MnSOD）被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物最重要的SOD［6，7］。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）可以代謝細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而抑制ROS 毒害作用，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是氧化產(chǎn)物的代表性產(chǎn)物，其含量的高低間接反映自由基損害所造成的脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，是反映自由基介導(dǎo)細(xì)胞損傷的指標(biāo)［8］。該研究的中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)提高了Mn-SOD 和GSH-PX 活性、mRNA 表達(dá)，促進(jìn)MDA的清除，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)了大鼠骨骼肌的抗氧化能力，避免了自由基對(duì)骨骼肌的損傷。

長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌中Mn-SOD 和GSHPX活性、mRNA表達(dá)降低，MDA水平升高，提示長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠的抗氧化能力降低，氧化損傷增加。長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，為了能夠提供足夠的能量，體內(nèi)代謝增加，體重減輕，線(xiàn)粒體耗氧量在增加，呼吸水平提高，產(chǎn)生更多的氧自由基，可能由于機(jī)體疲勞不能產(chǎn)生正常的生理應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化酶活性反而下降，不能有效消除運(yùn)動(dòng)引起的高ROS 和自由基水平，引起組織結(jié)構(gòu)功能紊亂，造成骨骼肌和腦等器官損傷［9，10］。

金雯等人［11］研究發(fā)現(xiàn)，每天0.5h、1h、2h 游泳訓(xùn)練均可以引起衰老大鼠股四頭肌SOD、GSH-Px活性的升高，以1h運(yùn)動(dòng)組效果最優(yōu)，并且有效地減少M(fèi)DA含量。潘瑋敏等人［12］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)4周游泳訓(xùn)練，小負(fù)荷訓(xùn)練組大鼠腓腸肌細(xì)胞膜MDA 含量降低，SOD 活性升高，大負(fù)荷訓(xùn)練組MDA 含量和SOD 活性無(wú)顯著性差異。雷曉妮等人［13］研究老年小鼠10周游泳運(yùn)動(dòng)后，無(wú)負(fù)荷老年運(yùn)動(dòng)組小鼠腓腸肌MDA 含量明顯下降，SOD活性顯著升高，GSH-PX 活性極顯著增高；負(fù)荷老年運(yùn)動(dòng)組小鼠腓腸肌GSH-PX 活性顯著升高，MDA 含量和SOD 活性無(wú)顯著性變化，負(fù)荷運(yùn)動(dòng)和無(wú)負(fù)荷運(yùn)動(dòng)交替組小鼠GSH-PX 和SOD 活性極顯著升高，MDA 含量明顯下降。朱天宇［14］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，低強(qiáng)度組和中強(qiáng)度組大鼠腓腸肌SOD 水平明顯升高，MDA水平明顯降低，而高強(qiáng)度組SOD 水平明顯降低，MDA水平明顯升高。

運(yùn)動(dòng)后提高機(jī)體抗氧化的能力不同，可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象和實(shí)驗(yàn)器官的選擇、運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間等因素有關(guān)，研究中同為設(shè)定的低、中、高負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)也各不相同，提示對(duì)不同對(duì)象開(kāi)具的運(yùn)動(dòng)處方應(yīng)采取個(gè)體化原則，以免造成機(jī)體的損傷。

睪酮是體內(nèi)主要的雄激素，男性大部分由睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，小部分由腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶產(chǎn)生。運(yùn)動(dòng)可以調(diào)節(jié)血清睪酮的變化［15，16］，運(yùn)動(dòng)性血睪酮變化一直是運(yùn)動(dòng)員身體機(jī)能檢測(cè)的常用指標(biāo)之一。該研究發(fā)現(xiàn)，安靜組和小強(qiáng)度組大鼠血清睪酮水平無(wú)顯著差異，中強(qiáng)度組血清睪酮水平顯著升高，大強(qiáng)度組血清睪酮水平降低明顯。雄激素在骨骼肌蛋白質(zhì)代謝和肌肉質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要作用，雄激素通過(guò)IGF-1/Akt、ERK/mTOR 和GPCR 等信號(hào)途徑促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)質(zhì)量增加，運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)了雄激素的促肌肉合成效應(yīng)［17，18］；而雄激素匱乏時(shí)可通過(guò)自噬、泛素蛋白酶體系統(tǒng)等途徑促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量的流失。

基于老年雄性存在睪酮水平降低［19，20］，老年雄性大鼠給予睪酮補(bǔ)充能夠改善運(yùn)動(dòng)行為和運(yùn)動(dòng)技能及增加中樞神經(jīng)腦的抗氧化能力和降低氧化損傷。去勢(shì)大鼠皮下給予丙酸睪酮后能夠恢復(fù)黑質(zhì)和海馬腦區(qū)線(xiàn)粒體的氧化應(yīng)激指標(biāo)［21］，表明雄激素不足引起的相關(guān)氧化應(yīng)激與體內(nèi)雄激素水平的減少有關(guān)。運(yùn)動(dòng)的影響是廣泛的，運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)或許與睪酮有協(xié)同效應(yīng)，還是通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)Mn-SOD、GSH-PX表達(dá)，還需進(jìn)一步研究。