黃鰭金槍魚酶解物免疫活性及其氨基酸分析

巫楚君, 潘劍宇, 蔡冰娜, 陶曙紅

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006;

2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301

隨著生活節(jié)奏加快、飲食習(xí)慣不規(guī)律、人口老齡化以及各種慢性病發(fā)病率的急劇增加, 免疫功能在預(yù)防和控制慢性疾病方面變得越來越重要。特別是受新冠疫情影響, 增強(qiáng)機(jī)體免疫力已成為國民健康的迫切需求。海洋生物富含優(yōu)質(zhì)且活性獨(dú)特的蛋白肽, 是食源性免疫增強(qiáng)蛋白肽的重要來源。研究發(fā)現(xiàn)扇貝多肽能顯著對(duì)抗地塞米松引起的小鼠脾臟白髓萎縮, 提高小鼠外周血T 淋巴細(xì)胞數(shù)量(張彩梅等, 2005); 阿拉斯加狹鱈胰蛋白酶蛋白水解物Pro-Thr-Gly-Ala-Asp-Tyr (PTGADY)可增強(qiáng)免疫抑制小鼠的體液、細(xì)胞和非特異性免疫(Hou et al,2016)。食品工業(yè)用酶是制備食品用途活性肽的常用工具酶, 其中木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的雙酶同時(shí)水解法也常見于海洋魚類活性肽的制備(楊萍等,2009; 紀(jì)麗娜, 2012)。

黃鰭金槍魚(Thunnus albacores)俗稱黃鯪甘、魚串子, 在分類學(xué)上隸屬于鱸形目金槍魚科金槍魚屬,分布于印度洋、太平洋、大西洋熱帶、亞熱帶水域,是金槍魚屬中漁業(yè)產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)魚種, 2018 年我國金槍魚年捕獲量已達(dá)到5.5 萬噸(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2019)。金槍魚在加工生產(chǎn)的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的碎肉、魚頭、內(nèi)臟等, 這些副產(chǎn)物最高可占原物質(zhì)的 70%(Guerard et al, 2002)。Sutanbawa 等(2006)報(bào)告稱, 金槍魚罐頭行業(yè)的廢棄物每年估計(jì)有45 萬噸之多, 這些副產(chǎn)物同金槍魚白肉一樣具有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、小分子肽和功能性氨基酸等活性成分, 表現(xiàn)出多種功能活性。據(jù)研究報(bào)道,張朋等(2014)從金槍魚(鰹魚)碎肉中獲得結(jié)構(gòu)為Phe-Gly- Gly-Val (FGGV)的四肽, 具有良好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性; He 等(2019)在金槍魚(鰹魚)肉中分離所得多肽, 可降低高尿酸血癥大鼠血清和肝臟天然黃嘌呤氧化酶活性; 杜帥等(2014)利用金槍魚碎肉制備高F 值寡肽, 高F 值寡肽產(chǎn)品具有改善肝性腦病、醒酒、護(hù)肝等生理功能; 黃鰭金槍魚腹部皮膚明膠經(jīng)堿性蛋白酶解的產(chǎn)物, 具有良好的抗氧化、清除亞硝酸鹽和抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性(Han et al, 2015); 內(nèi)臟經(jīng)復(fù)合蛋白酶水解后的產(chǎn)物經(jīng)膜超濾得到4 個(gè)餾分F1、F2、F3、F4, 餾分F4(＜3k Da)具有較高的抗氧化和抗菌特性(Pezeshk et al, 2019), 但金槍魚肽在免疫調(diào)節(jié)方面的研究鮮有報(bào)道。

本文利用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞模型,比較了幾種常用食品工業(yè)用酶水解黃鰭金槍魚碎肉所獲得酶解產(chǎn)物的免疫活性, 以期獲得活性較好的免疫活性肽的制備方法, 并通過分析活性肽的氨基酸組成和分子量分布, 為該多肽的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與細(xì)胞

金槍魚加工碎肉由廣東興億海洋生物工程股份有限公司提供, 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞購自美國ATCC 公司。

1.1.2 試劑及儀器

堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶購于南寧龐博生物工程有限公司; 高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青/鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffer saline, PBS)購于美國Gibco生物技術(shù)有限公司; 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購于美國Sigma 化學(xué)公司; 一氧化氮檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司; 中性紅購于索萊寶生物科技有限公司; 細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、和苯丙氨酸購于上海博升生物科技有限公司; L-氧化型谷胱甘肽購于上海源葉生物科技有限公司;所用的其他化學(xué)品和試劑均為分析級(jí)。所用儀器設(shè)備包括LA8080 氨基酸分析儀(日立, 日本)、1260高效液相色譜(Agilent, 美國)和VIVAFLOW 200 超濾膜包(sartorius, 德國)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃鰭金槍魚碎肉蛋白酶解液及超濾組分的制備

金槍魚酶解多肽的制備: 金槍魚碎肉, 用勻漿機(jī)攪成肉糜, 按照表1 條件加入蒸餾水, 攪拌3 次,分別用1mol·L-1的HCl 溶液和NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH,在水解溫度下預(yù)熱20min 后加入蛋白酶水解相應(yīng)的時(shí)間。水解后100℃沸水浴10min, 10000r·min-1, 4℃離心30min, 取上清液用0.2μm 濾膜抽濾, 濾過液用10k 和3k MWCO 超濾膜處理, ?。?k Da 濾過液濃縮, 冷凍干燥后獲得胃蛋白酶水解金槍魚多肽(tuna protein hydrolysated by pepsin, TPP)、胰蛋白酶水解金槍魚多肽(tuna protein hydrolysated by trypsin,TPT)和堿性蛋白酶水解金槍魚多肽(tuna protein hydrolysated by alcalase, TPA)。

表1 金槍魚肉酶解條件Tab. 1 Enzymolysis conditions of tuna meat

復(fù)合蛋白酶酶解多肽(tuna protein hydrolysated by pepsin and trypsin, TPPT)的制備: 取金槍魚糜300g, 加入 3 倍水體積蒸餾水, 攪拌 3 次, 用1mol·L-1HCl 調(diào)pH 至2.0, 37℃水浴預(yù)熱20min 后加入 2500U·g-1胃蛋白酶, 37℃酶解 2h 后, 加入1mol·L-1NaOH 溶液調(diào)pH 至8.0, 加入3000U·g-1胰蛋白酶, 37 ℃酶解4h 后, 后續(xù)滅活、離心、抽濾、濃縮、冷凍干燥操作同上, 獲得TPPT。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素(10000U·mL-1)和鏈霉素(10000μg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)基中(V/V), 在37 ℃, 5% CO2孵箱中培養(yǎng), 收集對(duì)數(shù)期RAW264.7 細(xì)胞用于免疫活性研究。

1.2.3 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響

將 RAW264. 7 細(xì)胞以5 × 105cells·mL-1, 每孔100μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 培養(yǎng)24h 后棄去上清液, 分別加入含終濃度為12.5、25、50、100、200、400 及800μg·mL-1樣品溶液, 每孔200μL, 空白對(duì)照組為含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基, 每組設(shè)6 復(fù)孔, 在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h 后, 于結(jié)束前4h 每孔加入5mg·mL-1的MTT, 每孔20μL, 4h 棄上清液, 加入DMSO 150μL, 振蕩10min, 置于酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定OD 值, 并按公式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖率Cr。

式中A1、A0分別為樣品的吸光度和空白對(duì)照的吸光度。

1.2.4 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力的影響

將 RAW264. 7 細(xì)胞以5×105cells·mL-1, 每孔100μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 培養(yǎng)24h 后棄去上清液, 分別加入含終濃度為12.5、25、50、100、200、400 及800μg·mL-1樣品溶液, 每孔200μL, 空白對(duì)照組為含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基, 每組設(shè)6復(fù)孔, 在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h 后, 棄去上清液, 每孔加入100μL 0.1%中性紅溶液, 在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1h 后吸出中性紅溶液, 用PBS 洗3 次,向各孔加入100μL 細(xì)胞裂解液(乙酸: 無水乙醇=1∶1,V/V), 室溫放置2h, 置于酶標(biāo)儀540 nm 處測(cè)定OD 值, 并按公式(2)計(jì)算吞噬率Cp。

式中A1、A0分別為樣品的吸光度和空白對(duì)照的吸光度。

1.2.5 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放量的影響

將RAW264. 7 細(xì)胞以5×105cells·mL-1, 每孔100μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 培養(yǎng)24h 后棄去上清液, 分別加入含終濃度為50、100 及200μg·mL-1樣品溶液, 每孔200μL, 空白對(duì)照組為含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基, 每組設(shè)4 復(fù)孔, 在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h 后, 收集各孔中的細(xì)胞培養(yǎng)上清,用NO 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清中的NO 含量, 操作按說明書進(jìn)行, 置于酶標(biāo)儀570nm 處測(cè)定OD 值, 并按公式(3)計(jì)算NO 的增加量INO。A1、A0分別為樣品的吸光度和空白對(duì)照的吸光度。

1.2.6 氨基酸組分分析

酸水解: 準(zhǔn)確稱取樣品放入水解管中, 加入6mol HCl, 封管, 于110℃水解22h, 冷卻, 定容, 過濾, 蒸發(fā)去過量鹽酸, 用檸檬酸鈉緩沖液溶解, 采用LA8080 氨基酸分析儀(日立, 日本)分析。分析條件: 磺酸型陽離子樹脂 2.6mm×150mm; 檢測(cè)波長570nm 和440nm。

堿水解測(cè)色氨酸: 準(zhǔn)確稱取樣品放入水解管中,加入4mol·L-1的LiOH 堿水解劑1.5mL, 連接活塞排抽真空約10～15min, 立即封口, 于110℃水解20h, 水解管冷卻后切開管口, 用檸檬酸鈉緩沖液將水解定量轉(zhuǎn)移到25mL 容量瓶中, 再加入6mol·L-1HCl 中和, 并用檸檬酸緩沖液定容, 用0.45μm 濾膜過濾取上清液, 采用1100 高效液相儀(安捷倫, 美國)分析, 色譜柱:MN-C18, 流動(dòng)相: 0.0085mol·L-1乙酸鈉緩沖液和甲醇(95∶5), 流速1.5mL·min-1, 波長280nm, 進(jìn)樣量15μL。

氨基酸組成比較采用Heml 1.0.3.7 進(jìn)行層次聚類分析。

1.2.7 分子量分布分析

采用凝膠排阻色譜進(jìn)行分子量的測(cè)定。取3mg·mL-1的樣品溶液, 用0.22μm 的濾膜過濾后進(jìn)色譜柱TSK gel G2000SWXL(300mm×7.8mm)。用乙腈/水/三氟乙酸(20/80/0.1,V/V/V)作流動(dòng)相, 檢測(cè)波長 220nm, 流速 0.5mL·min-1, 柱溫 35 ℃, 進(jìn)樣量5μL。用細(xì)胞色素C(M:12355), 抑肽酶(M:6511), 桿菌肽(M:1422), L-氧化型谷胱甘肽(M:612.63)和苯丙氨酸(M:165.2)作為相對(duì)分子質(zhì)量校正標(biāo)準(zhǔn)。以標(biāo)準(zhǔn)品的logMw 及洗脫時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y= -0.0169x2+0.3475x+2.3846,R2=0.9986)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和處理,P＜0.05 表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異,P＜0.01表示數(shù)據(jù)具有極顯著性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞體外活性篩選

2.1.1 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖活性的影響

MTT 比色法常用以反映活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活力, 廣泛用于免疫學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)(白生賓 等, 2011)。結(jié)果如圖1 所示, 不同濃度的TPPT、TPP、TPA 和TPT對(duì)RAW264.7 細(xì)胞作用24h 后, 隨著濃度的增加, 細(xì)胞的增殖率出現(xiàn)先平緩后下降的趨勢(shì)。當(dāng)樣品濃度在12.5～200μg·mL-1較低范圍內(nèi)時(shí), 金槍魚肉酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的增殖率影響不顯著, 沒有明顯的細(xì)胞毒性作用。濃度大于 400μg·mL-1時(shí), 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用, 與空白對(duì)照相比有極顯著性差異(P＜0.01)。

圖1 不同濃度金槍魚肉酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖活性影響與空白組對(duì)比, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01Fig. 1 Effects of different concentrations of tuna enzymatic hydrolysates on RAW264.7 cell proliferation activity

2.1.2 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞在脊椎動(dòng)物體內(nèi)參與先天性免疫和細(xì)胞免疫, 是重要的免疫細(xì)胞, 其激活與否是檢測(cè)候選活性物免疫活性的重要標(biāo)志之一(Lin et al, 2017)。本文采用中性紅法檢測(cè)各組RAW264.7 細(xì)胞吞噬功能的變化, 結(jié)果如圖2 所示, 在12.5～400μg·mL-1范圍內(nèi), 隨著濃度的增加, TPPT、TPP 和TPT 的吞噬率呈上升趨勢(shì); 在濃度為400μg·mL-1時(shí)達(dá)到最大,TPPT、TPP 和TPT 的吞噬率分別為131.25%、122.88%和132.50% (P＜0.01); 當(dāng)濃度大于400μg·mL-1時(shí), 吞噬率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。而TPA 的吞噬能力無明顯變化,與空白組相比無顯著差異。

圖2 不同濃度金槍魚肉酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力影響與空白組對(duì)比, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01Fig. 2 Effects of different concentrations of enzymatic hydrolysates on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.1.3 酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放量的影響

NO 是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子, 也是參與免疫反應(yīng)的重要免疫因子, 在內(nèi)毒素致機(jī)體損傷中起重要作用(Yang et al, 2002)。在免疫應(yīng)答初期, 巨噬細(xì)胞在免疫活性物質(zhì)的作用下, 會(huì)活化并釋放適量NO 等免疫因子, 進(jìn)而參與免疫反應(yīng), 適量的NO 可以直接殺死病原體、降低病原體復(fù)制功能, 同時(shí)還能抑制腫瘤細(xì)胞生長甚至可以殺傷腫瘤細(xì)胞。本文采用Griess 試劑檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO 含量。結(jié)果如圖3 所示, 與空白對(duì)照組相比, 不同濃度TPT均可極顯著促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞生成NO(P＜0. 01), 且NO 釋放量與酶解液濃度存在一定的量效關(guān)系, 在濃度為200μg·mL-1時(shí), NO 產(chǎn)量增加量高達(dá)286.33%, 而其他酶解物與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。

圖3 不同濃度金槍魚肉酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的影響與空白組對(duì)比, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01Fig. 3 Effects of different concentrations of tuna enzymatic hydrolysates on the release of NO in RAW264.7 cells

2.2 酶解物氨基酸組分分析

氨基酸是人體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì), 與免疫系統(tǒng)的組織、器官發(fā)育密切相關(guān), 進(jìn)入體內(nèi)后被重新分配, 參與炎癥和免疫反應(yīng)。4 種酶解物中氨基酸組成的聚類分析見圖4, 4 種金槍魚碎肉酶解物氨基酸含量豐富, 必需氨基酸含量高達(dá)47.89%, 其中TPT 的必需氨基酸含量最高, 占該組分氨基酸總量的51.09%。如圖4 所示, TPP 和TPA 的水解產(chǎn)物形成了兩個(gè)非常緊密的簇。TPPT 水解物的氨基酸組成也與TPP 和TPA 的水解物有一些相似之處, 但落在更寬的距離上; TPT 水解物與其他水解物距離最寬, 說明酶解物TPP 和TPA 的氨基酸組成較為接近; 而TPT與其他3 個(gè)酶解物的氨基酸組成有著較大差距, 其中由圖4 和表2 可知, TPT 的組氨酸、賴氨酸和精氨酸等3 個(gè)堿性氨基酸的相對(duì)含量較高, 分別為11.59%、11.00%和6.90%, 均高于其他酶解物。

圖4 樣品氨基酸組成層次聚類分析圖Fig. 4 Cluster analysis diagram of amino acid composition hierarchy of samples

表2 酶解樣品氨基酸組成Tab. 2 Amino acid composition of enzymolysis sample

2.3 酶解物分子量分布

酶解物的分子量分布如表3 所示, TPP 和TPT相比, 都是特異性酶切位點(diǎn), 且都含有小分子肽,但胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)比胃蛋白酶更為嚴(yán)格, 且TPT 的活性更好; TPT 與TPA 相比, 分子量分布相近,但堿性蛋白酶是非特異性酶, 胰蛋白酶為特異性蛋白酶, 水解Lys 和Arg 形成肽鍵, 因此經(jīng)胰蛋白酶酶解后的肽鏈末端氨基酸大多以Lys 和Arg 存在, 綜合提示活性與酶切位點(diǎn)有關(guān); TPPT 與TPT 相比, 小于0.5k Da 的組分含量高達(dá)88.08%, TPPT 為復(fù)合酶酶解產(chǎn)物, 可能更多的釋放出游離氨基酸, 使其活性弱于TPT, 提示TPPT 會(huì)破壞相關(guān)活性序列特征。

表3 酶解物不同分子量范圍所占峰面積百分比Tab. 3 Percentage of peak area of enzymatic hydrolysates with different molecular weight ranges

3 討論

機(jī)體遭遇外來異物攻擊時(shí), 會(huì)激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用, 而免疫活性肽具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用, 促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO 等功能。巨噬細(xì)胞的增殖能力、吞噬能力、NO 釋放能力等是評(píng)價(jià)其是否被激活的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金槍魚肉不同蛋白酶酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的免疫活性, 研究顯示,不同濃度胰蛋白酶酶解產(chǎn)物TPT 作用于RAW264.7細(xì)胞24h 后, 均可增強(qiáng)其吞噬作用, 促進(jìn)其NO 釋放,顯示胰蛋白酶酶解產(chǎn)物具有明顯的免疫活性。這一結(jié)果與Hou 等(2012, 2016)用胰蛋白酶酶解鱈魚的研究相似。TPT 表現(xiàn)出對(duì)RAW264.7 細(xì)胞顯著的NO釋放提升作用, 可能與其能誘導(dǎo)細(xì)胞中iNOS 的表達(dá)有關(guān)(Lind et al, 2017)。

氨基酸在人類免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著各種作用, 蘇氨酸在免疫球蛋白中含量豐富, 在維持腸道固有免疫屏障完整性方面起重要作用; 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸屬支鏈氨基酸, 支鏈氨基酸能促進(jìn)Th1 型免疫反應(yīng)的進(jìn)行; 色氨酸在血漿和組織中濃度較低,但其產(chǎn)生的中間代謝物會(huì)生成自由基清除劑和抗氧化劑, 從而參與機(jī)體免疫反應(yīng); 組氨酸經(jīng)催化生成的組氨在炎癥和過敏反應(yīng)中扮演重要角色(王曉芳等, 2013), 這些氨基酸都屬于必需氨基酸(EAA), 與其他酶解物相比, TPT 中EAA 含量最高; 此外, 賴氨酸能將抗原和T 細(xì)胞連接在一起, 使T 細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)抗原的特異效應(yīng), 具有增強(qiáng)人體免疫的功能(Ghosh et al, 2008); 精氨酸可減少手術(shù)后內(nèi)毒素和應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生(Hou et al,2012), 可增加肝臟中精氨酸酶的活性, 有助于將血液中的氨轉(zhuǎn)化為尿素排出去, 提高機(jī)體免疫功能(Mizock, 2010; 張愛琳 等,2016)。Hou 等(2012)研究發(fā)現(xiàn)阿拉斯加狹鱈骨胰蛋白酶酶解物具有較高的免疫調(diào)節(jié)活性, 這可能因?yàn)槠涓缓K氨酸、谷氨酸、精氨酸和半胱氨酸這些與免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)的氨基酸。這提示酶解物的氨基酸組成與免疫調(diào)節(jié)活性有較大關(guān)聯(lián), TPT 除了含有上述具有免疫調(diào)節(jié)活性的EAA, 還富含賴氨酸和精氨酸, 因胰蛋白酶專屬水解賴氨酸和精氨酸所形成的肽鍵。因此, TPT 所具有的免疫活性可能與胰蛋白酶酶解物的氨基酸組成有關(guān)。

葉盛旺等(2019)研究發(fā)現(xiàn)青蛤多肽高免疫活性組分的分子量小于3kDa; 楊萍等(2010)研究發(fā)現(xiàn)黃鰭金槍魚魚頭酶解物小于1k Da 組分單獨(dú)作用能明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。由分子量分布結(jié)果可以看出,TPT 分子量小于1k Da 的含量高達(dá)97.48%, 由此推測(cè)TPT 酶解物3k Da 超濾組分具有較高的免疫活性可能與其小肽序列的必需氨基酸和堿性氨基酸組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

綜上所述, 胰蛋白酶酶解黃鰭金槍魚肉得到的小于3k Da 超濾組分, 值得深入分析結(jié)構(gòu)組成與研究其作用機(jī)制, 為進(jìn)一步開發(fā)具有增強(qiáng)免疫力功效的金槍魚肽食品提供理論依據(jù)及參考。