長鏈非編碼RNA調(diào)控不同來源干細胞成骨分化機制的研究進展*

林梓聰 劉建全 趙喆 李文翠 熊建義

肌肉骨骼疾病是全世界都面臨的重大醫(yī)療問題，而有研究指出肌腱疾病約占肌肉骨骼疾病的30%；甚至在美國，僅2008 一年便有約200 萬人因為肌腱問題咨詢醫(yī)生[1]。即便如此，經(jīng)過治療后的損傷肌腱也并不能保證恢復(fù)如初，極易遺留各種各樣的后遺癥，令患者痛苦不堪。肌腱病也稱肌腱炎，常見的肌腱疾病包括肩袖肌腱炎、肱二頭肌長頭腱炎、髕腱炎和跟腱炎等，而肌腱炎不僅常見于職業(yè)運動員，也多見于重體力勞動者、護理助手等需要長時間、高強度使用肌腱的人群。另外，在肌腱修復(fù)的生理過程中，很容易出現(xiàn)因為肌腱修復(fù)失敗而導(dǎo)致的肌腱鈣化現(xiàn)象，極大地削弱肌腱本身的生物力學(xué)強度，使得患者后續(xù)的工作、生活及運動等受到極大影響。

以往有實驗[2]證明干細胞（包括骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪來源干細胞等）有一定的遷移能力，而肌腱病導(dǎo)致肌腱中產(chǎn)生的異?；|(zhì)成分（如脂肪降解、粘多糖積聚、細胞變圓、軟骨細胞表型、鈣化）提示有非肌腱細胞遷移到受損部位，或是內(nèi)源性或外源性的有多向分化潛能的干細胞分化成為非肌腱樣細胞。

關(guān)于這其中的機制，眾說紛紜?，F(xiàn)有諸如經(jīng)典Wnt 細胞信號通路、MAPK 通路及非經(jīng)典Wnt 通路等學(xué)說，而長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）這一調(diào)控分子因其在眾多生命活動乃至疾病進展中均發(fā)揮重要作用，近年來也成為遺傳學(xué)，特別是表觀遺傳學(xué)的研究熱點。但是關(guān)于lncRNA 是如何參與肌腱鈣化的調(diào)控過程，至今尚未完全清楚。筆者認為，探索lncRNA 如何調(diào)控不同來源干細胞的成骨分化活動，可以加深我們對肌腱病肌腱鈣化的認識，能更深入地闡述肌腱病肌腱鈣化的發(fā)病機制，為肌腱病的治療提供可能的新靶點。

1 長鏈非編碼RNA 和微小RNA

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度大于200 個核苷酸，缺乏開放讀框的非編碼功能性RNA。細胞中亦有許多種類的其他非編碼RNA，但相較于微小RNA（microRNA，miRNA），Piwi 互動RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）序列保守性較高，lncRNA 序列保守性較低。也正因為如此，lncRNA 能通過多種不同的機制在不同階段、不同水平調(diào)控相關(guān)基因的表達。哺乳動物基因組中4%～9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA，而相應(yīng)編碼蛋白的RNA，即mRNA的比例是1%左右。但是，與mRNA 相比，其表達的豐度并不高，lncRNA 主要在細胞發(fā)育、分化等特定階段較多量地表達，以調(diào)控這些過程，具有明顯的組織細胞表達特異性。以往許多研究[3-4]表明，lncRNA 在劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用，近年來是表觀遺傳學(xué)研究的熱點。

miRNA 是一類內(nèi)生的長度為20～24 個核苷酸的小RNA，是RNA 介導(dǎo)沉默復(fù)合體的組成部分，通過結(jié)合同源的3'UTR 區(qū)域來發(fā)揮其沉默靶基因表達的作用。從序列上來看，其具有高度的保守性及同源性；從生物學(xué)功能來看，miRNA 大量地參與調(diào)控人類約1/3 的基因表達，而這種調(diào)控作用可以使一類miRNA 調(diào)控多個基因的表達，也可以使多個miRNA 精準調(diào)控一個基因的表達。

2 長鏈非編碼RNA（lncRNA）促進干細胞成骨分化

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）是常用于研究干細胞分化機制的干細胞，這有賴于其多向分化性及可在體外表達多種目的基因的特性。因此，近年來，有不少學(xué)者利用骨髓間充質(zhì)干細胞研究lncRNA調(diào)控其分化的分子生物學(xué)機制。

骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化過程有眾多因子參與。Zhang等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（bone morphogenic protein-1，BMP-1）可以促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化；而miRNA-29b-3p 可以抑制BMP-1 的表達；lncRNA NEAT1 可以通過結(jié)合miRNA-29b-3p 來促使BMP-1 表達并發(fā)揮其誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的生物學(xué)作用。Wu等[6]學(xué)者則證明了在骨髓間充質(zhì)干細胞中l(wèi)ncRNA DGCR5通過與miRNA-30d-5p 作用來上調(diào)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）這種能介導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化的蛋白的表達，以此誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

骨質(zhì)疏松癥是困擾中老年人及臨床醫(yī)生的一大疾病，其基本特點是骨量的進行性丟失。因此，近年有學(xué)者研究骨質(zhì)疏松癥下的骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化過程。Gao 等[7]發(fā)現(xiàn)miRNA-143 可以通過抑制成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（osterix，Osx）的表達來抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。而lncRNA MALAT1 可以直接結(jié)合miRNA-143 使其失活，使Osx 表達增加，從而促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。Shang 等[8]發(fā)現(xiàn)，在糖皮質(zhì)激素處理過的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中，lncRNA TCONS_00041960 可以與miRNA-204-5p 及miRNA-125a-5p 作用，抑制它們的生物學(xué)功能，進而上調(diào)Runx2、Osx 及骨鈣素（osteocalcin，OCN）等成骨因子的表達量、抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體-（peroxisome proliferators-activated receptor-，PPAR-）等成脂分化因子的表達，以此來促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化并抑制其成脂分化。同樣是研究骨量進行性流失的Li 等[9]學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNA Bmncr 的過表達可以減緩實驗小鼠的骨質(zhì)流失，甚至可以改變細胞分化決定，逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細胞的分化方向，將本分化向脂肪細胞的干細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉只虺晒羌毎?。他們認為lncRNA Bmncr可以在更高層次上調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的分化。

Wu 等[10]發(fā)現(xiàn)，在一定的機械張力下，lncRNA H19 可以通過吸附microRNA-138，介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化順利進行。Li 等[11]在針對廢用性骨質(zhì)疏松癥的研究中發(fā)現(xiàn)了lncRNA H19 可能的調(diào)控通路：在編碼lncRNA H19基因被敲除的UMR106 細胞（一成骨細胞系）中，成骨分化過程被抑制，而編碼lncRNA H19 及Dkk4 蛋白的基因均被敲除的UMR106 細胞中，成骨分化過程卻是被促進的；同時，在二者的Wnt 信號通路研究中，均發(fā)現(xiàn)了Wnt 信號通路的改變與成骨過程的改變是一致的。因此他們認為，lncRNA H19 與Dkk4 蛋白的相互作用，并通過Wnt 信號通路來調(diào)控廢用性骨質(zhì)疏松動物中的成骨分化過程。

對于骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，近年來的研究均認為lncRNA 或通過與miRNA 相互作用、或在細胞分化決定的層面參與干細胞分化的調(diào)控；而且，這些效應(yīng)在骨質(zhì)疏松癥來源的干細胞上表現(xiàn)得更為明顯。這或許能為以后更深層次的研究提供文獻證據(jù)支持。

2.2 脂肪來源干細胞

Zuk 等[12]于2001 年首次在人脂肪組織中分離出脂肪來源干細胞。自此種具多向分化性、易得性和無免疫原性的干細胞被發(fā)現(xiàn)后，越來越成為遺傳學(xué)、細胞學(xué)的研究熱點對象。相應(yīng)地，亦有越來越多的學(xué)者利用脂肪來源干細胞來研究其中l(wèi)ncRNA 參與調(diào)控成骨分化的機制。

以往有研究表明，白介素-6（interlukin-6，IL-6）等炎癥因子可以提高Runx2 等成骨分化標記物的表達，從而促進干細胞或其他細胞的成骨分化。Wu 等[13]在其針對人類脂肪來源干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-665 可以抑制IL6的表達，而lncRNA HIFA-AS2 可以通過結(jié)合miRNA-665，并激活PI3K/Akt 信號通路來上調(diào)IL6 的表達，調(diào)控脂肪來源干細胞的成骨分化。而Jin 等[14]在研究炎癥環(huán)境下的脂肪來源干細胞時發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）和白介素-17（interlukin-17，IL-17）等炎癥因子可以通過活化核因子B（nuclear factor kappa-B，NF-B）來抑制脂肪干細胞向成骨細胞分化；反之，炎癥微環(huán)境及炎癥因子也可以通過NF-B 信號來使lncRNA MIR31HG 的表達量上升，這會抑制脂肪干細胞向成骨細胞分化。

Yi 等[15]發(fā)現(xiàn)，人類脂肪來源干細胞在成骨分化過程中會表達更多的lncRNA MALAT1 和更少的miRNA-30。更進一步的研究顯示，lncRNA MALAT1 是通過結(jié)合miRNA-30來促進Runx2 的表達，以此促進脂肪來源干細胞的成骨分化。Li 等[16]在利用脂肪來源干細胞進行研究時發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 的表達量在其成脂分化時下降，而在其成骨分化時上升，且在編碼lncRNA MEG3 的基因被敲除后，干細胞成脂分化被激活，而成骨分化則被抑制；結(jié)合體外細胞實驗，他們推斷，lncRNA MEG3 是脂肪來源干細胞向脂肪分化抑或是成骨分化的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)miRNA-140-5p 的水平來實現(xiàn)調(diào)控。

類似地，近年來的研究顯示lncRNA也可以通過與miRNA相互作用來調(diào)控脂肪來源干細胞的成骨分化過程。然而，與lncRNA 參與調(diào)控骨髓來源干細胞成骨分化過程有所不同的一點是，從文獻所展示的實驗結(jié)果來看，炎癥環(huán)境及炎癥因子（包括IL-6、TNF-及IL-17 等）是極為重要的一環(huán)，lncRNA、microRNA 和炎癥因子共同調(diào)控在炎癥環(huán)境中脂肪來源干細胞的成骨分化。

2.3 牙源干細胞

Gronthos 等[17]在2000 年分離出第一種牙源干細胞--牙髓干細胞后，陸續(xù)有7 種牙源干細胞被發(fā)現(xiàn)，并在后續(xù)大量實驗中被證實它們可以表現(xiàn)出與其他來源的間充質(zhì)干細胞相似的多向分化性，而這也為后續(xù)應(yīng)用于治療臨床上多種疾病提供了另一個可能。前文提到lncRNA MEG3 在脂肪來源干細胞中可以通過與miRNA-140-5p相互作用來促進干細胞的成骨分化，然而，Deng 等[18]在研究人類牙囊干細胞的成骨分化時似乎有完全相反的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 抑或是lncRNAEZH2 表達量的下降可以活化Wnt/ -catenin信號通路，并以此促進人牙囊干細胞的成骨分化。Wang 等[19]在研究牙周炎患者的牙周膜干細胞時，利用體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA POIR 可以通過吸附miRNA-182 調(diào)控Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子1（Forkhead box protein O1，F(xiàn)ox O1）的表達水平來促進牙周膜間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

Gu 等[20]也利用牙周膜干細胞在體外誘導(dǎo)其成骨分化，并成功識別出960 種差異性表達的lncRNA 和1 456 種差異性表達的circRNA。他們認為，這項工作可以為未來的牙周膜干細胞成骨分化機制研究工作提供更好的思路及數(shù)據(jù)庫。

近年來的文獻研究較少使用牙源干細胞作為實驗對象，但研究成果顯示同一類lncRNA在不同來源的干細胞中所充當(dāng)?shù)慕巧⒉灰恢?，甚至是完全相反的。這也提示我們在探討lncRNA 參與干細胞成骨分化的調(diào)控機制這一問題時，需要嚴格限定細胞來源、lncRNA 種類等條件，否則可能得到有偏差甚至完全錯誤的結(jié)論。

2.4 利用數(shù)據(jù)庫篩選可能的lncRNA 及miRNA 等分子

以上實驗均是聚焦于細胞中的某一類lncRNA與下游調(diào)節(jié)因子相互作用，另有Huang 等[21]利用人脂肪來源干細胞在體外誘導(dǎo)其成骨分化，并在該過程中識別出了1 460 種表達量上升和1 112 種表達量下降的lncRNA。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，若lncRNA H19 的基因被沉默，則會顯著降低包括ALP 和Runx2 等在內(nèi)的成骨分化關(guān)鍵因子的表達量，也就是抑制了脂肪來源干細胞的成骨分化。類似于Huang 等學(xué)者的工作，Xie 等學(xué)者[22]在利用強直性脊柱炎患者的間充質(zhì)干細胞和正常人群的間充質(zhì)干細胞進行體外誘導(dǎo)成骨分化實驗時也篩查出520 種差異性表達的lncRNA和665 種差異性表達的mRNA，同時亦涉及到64 條有顯著差異的信號通路。作者經(jīng)分析后還發(fā)現(xiàn)lncRNA ZNF354A-A、lncRNA LIN54-1、lncRNA FRG2C-3 和lncRNA USP50-2 這4 種lncRNA 可能介導(dǎo)強直性脊柱炎患者體內(nèi)異常間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

在細胞實驗中不注重研究具體的某種或某些lncRNA如何參與調(diào)控干細胞的成骨分化過程，而是利用相關(guān)技術(shù)進行分析、篩選后得到可能參與調(diào)控分化的lncRNA 亦是近年來部分學(xué)者的研究熱點。筆者認為，這一方法雖不能揭示某一具體的機制，但可以為后來的研究者提供一定的參考。

3 長鏈非編碼RNA（lncRNA）抑制干細胞成骨分化

3.1 骨髓間充質(zhì)干細胞

利用骨質(zhì)疏松動物模型或臨床標本研究其中骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化過程。

Feng 等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA BDNF-AS 表達量的增加可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分裂并抑制其成骨分化；但具體是通過何種通路進行調(diào)控的作者并無過多闡述。由于作者利用卵巢切除來建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動物模型進行實驗，所以他們推測或許lncRNA BDNF-AS 是通過雌激素通路來調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化的，但這仍需要后續(xù)更多的研究。而Wang 等學(xué)者[24]同樣利用卵巢切除來建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動物模型，給出了一個可能的答案。他們發(fā)現(xiàn)在卵巢切除動物模型及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的骨髓間充質(zhì)干細胞中，lncRNAMEG3 可以調(diào)控miRNA-133a-3p 的表達，并可與之相互作用來抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。

Jiang 等學(xué)者[25]在研究骨質(zhì)疏松時發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細胞在被誘導(dǎo)成骨分化時，lncRNA SNHG1 的表達量是下降的。進一步的實驗證實，lncRNA SNHG1 可以通過p38MARK信號通路抑制p38 活性及骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。同時作者也發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)，lncRNA SNHG1 的低表達可以通過促進p38 的活化來減緩骨質(zhì)疏松的進展，這或許能為將來的骨質(zhì)疏松防治提供新的思路和靶點。同樣研究骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的p38MARK 信號通路，Zhang 等[26]發(fā)現(xiàn)，Runx2、OCN 等成骨過程中關(guān)鍵因子的基因表達會被lncRNA DANCR的過表達所抑制，如若編碼lncRNA DANCR的基因被敲除，這些因子的表達會被活化，轉(zhuǎn)而促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖及成骨分化。后續(xù)實驗證實lncRNA DANCR 亦是通過p38MARK 信號通路來調(diào)控上述現(xiàn)象的。

近年來的研究結(jié)果顯示，lncRNA 亦是通過與miRNA相互作用以抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化，而這一過程也是在骨質(zhì)疏松癥中較為明顯；此外，筆者認為，諸如Runx2及OCN 等成骨因子在這一過程中的作用亦是不可忽視的。

3.2 其他干細胞

Gong 等[27]觀察到髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生的假體周圍溶骨改變中有關(guān)節(jié)假體磨損顆粒的影響，體外實驗證實經(jīng)過關(guān)節(jié)假體磨損顆粒類似物處理，間充質(zhì)干細胞中發(fā)現(xiàn)了lncRNA PRCNR1 表達量增加，其可以通過抑制Runx2、Osx 和OCN等成骨關(guān)鍵因子的活性來抑制成骨分化。這可以解釋髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后出現(xiàn)的關(guān)節(jié)假體周圍溶骨現(xiàn)象。Wei 等[28]在研究非創(chuàng)傷性股骨頭壞死時發(fā)現(xiàn)，相較于骨關(guān)節(jié)炎患者及正常人，股骨頭壞死患者的間充質(zhì)干細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR 的表達量增加而miRNA-17-5p 的表達量減少。而編碼lncRNA HOTAIR 的基因被敲除后，miRNA-17-5p 表達量增加，同時增加了Runx2 等成骨分化關(guān)鍵因子的表達。

臨床上，許多疾病均能導(dǎo)致病變骨的骨量大量丟失，這種丟失的后果便是病變骨的生物力學(xué)遭到嚴重削弱，這對患者的日常生活是極為不利的。研究指出，某些lncRNA 在這其中亦是充當(dāng)關(guān)鍵角色，筆者認為，這可以為以后研究針對這些疾病的新療法提供思路及實驗證據(jù)支持。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，作為表觀遺傳學(xué)研究的新晉熱點，近年來有愈來愈多的研究針對lncRNA。正如前文所介紹的，lncRNA作為非編碼RNA 家族的重要一員，在真核生物的生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用。而且，大量研究表明，lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄階段、轉(zhuǎn)錄后翻譯階段及表觀遺傳修飾階段調(diào)控相應(yīng)的基因表達，從而在基因印跡、細胞周期及劑量補償?shù)壬飳W(xué)過程發(fā)揮其相應(yīng)的調(diào)控作用。lncRNA 在干細胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，許多l(xiāng)ncRNA 與骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪來源干細胞及牙源干細胞等的成骨分化過程有關(guān)，lncRNA 可以通過與一種或多種microRNA 相互作用以調(diào)控后續(xù)信號通路，進而調(diào)控干細胞成骨分化過程；而同一種lncRNA 在調(diào)控不同來源的干細胞成骨分化中，可以通過不同的信號通路起到截然相反的調(diào)控效應(yīng)；某一些lncRNA甚至在此過程中扮演一個調(diào)控細胞決定的重要作用，可以左右干細胞的分化方向。

此外，這些研究大多數(shù)是以骨髓間充質(zhì)干細胞這一類易獲得，實驗技術(shù)成熟的干細胞為實驗對象，并有部分學(xué)者選擇使用脂肪來源干細胞及牙源干細胞，以探究特定細胞成骨分化的調(diào)控機制。但是，鮮有學(xué)者關(guān)注到肌腱干細胞（tendonderived stem cell，TDSC）這一類較為冷門的肌腱組織內(nèi)源性干細胞，更遑論對其成骨分化機制及其調(diào)控機制的探索。2007 年美國的Bi 等[29]首次在離體組織分離出TDSCs，Rui等[30]也于2010 年的報道中首次在大鼠活體肌腱組織中分離出了TDSCs；隨后，許多學(xué)者也在其他種屬生物肌腱組織中分離出了TDSCs?，F(xiàn)已經(jīng)證實，TDSCs 是一類廣泛存在于諸如人類、大鼠、小鼠等不同種屬生物體內(nèi)的干細胞。這類干細胞可以在定向誘導(dǎo)的情況下，分化成為骨、軟骨與脂肪等組織。而TDSCs 這類肌腱內(nèi)源性的干細胞相較于骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪來源干細胞及牙源干細胞等肌腱外源性的干細胞，可能對于解決肌腱病及肌腱鈣化這一困擾大量患者的疾病有更直接的意義。

目前，關(guān)于lncRNA 對TDSCs 成骨分化調(diào)控機制的探索實驗及其報道仍是少數(shù)，筆者認為，探索lncRNA在TDSCs誘導(dǎo)成骨分化過程中的調(diào)控機制，對于闡明肌腱病肌腱鈣化發(fā)生過程中的分子機理具有重要意義，對未來肌腱病肌腱鈣化的臨床分子治療發(fā)展可以提供新方法。