3D 打印骨組織工程支架的制備技術(shù)*

何瀟 何揚波 朱少奎 何黎冰 王晗 王翀

3D打印技術(shù)作為一種增材制造的方式在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注，主要有2 個原因：一是其多功能性、易用性和制造過程的精確控制，二是定制的骨組織工程支架具有不規(guī)則形狀的結(jié)構(gòu)和性能[1]。除此之外，骨組織工程支架為細(xì)胞提供一個導(dǎo)電的微環(huán)境，模擬人體組織的多尺度結(jié)構(gòu)[2]并能作為一個提供藥物（生物分子[3]）的優(yōu)良載體。近年來，隨著國內(nèi)外科研專家在骨組織工程支架方面的深入研究，骨組織工程支架開始被賦予更多新功能，本文總結(jié)了2014—2019 年來3D打印骨組織工程支架的制備方式及材料和性能，介紹設(shè)計和制作骨組織工程支架的思路以及最新的研究成果。

1 3D 打印骨組織工程支架的材料及性能要求

骨再生是非常復(fù)雜的，其中涉及大量分子、細(xì)胞、生物和機械方面的因素。因此，誘導(dǎo)骨再生的多孔骨組織工程支架需要具有合適形狀、孔徑、孔隙率、降解性、生物相容性、力學(xué)性能和理想細(xì)胞反應(yīng)等一系列要素。

1.1 骨組織工程支架的材料種類

骨組織工程支架的材料很多樣：生物陶瓷粉末、天然/合成水凝膠、天然/合成聚合物及其復(fù)合材料，如表1 所示[4-10]。

表1 骨組織工程支架的材料種類

1.2 骨組織工程支架的結(jié)構(gòu)

1.3 骨組織工程支架的機械性能

人體骨組織由皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨組成。皮質(zhì)骨致密，孔隙率僅為5%～10%；松質(zhì)骨為海綿狀結(jié)構(gòu)，孔隙率為50%～90%。皮質(zhì)骨占人體骨骼重量的80%，而松質(zhì)骨占20%。皮質(zhì)骨的抗壓強度和楊氏模量明顯高于松質(zhì)骨[12]。所以制備支架時，需要使其有匹配的力學(xué)性能，提供足夠的力學(xué)支撐。

1.4 骨組織工程支架的細(xì)胞反應(yīng)

骨組織工程支架能否誘導(dǎo)良好的細(xì)胞反應(yīng)也是支架設(shè)計的重要內(nèi)容。首先，該支架應(yīng)具有生物相容性，在體內(nèi)外均無急性或長期毒性。其次，由于細(xì)胞的初始黏附、擴散和增殖與支架表面的潤濕性等性質(zhì)密切相關(guān)，因此需要提供具有適當(dāng)表面親水性的支架材料，而這可以通過在支架表面涂敷親水聚合物和肽、生物分子等生物制劑來實現(xiàn)。此外，為了改善骨再生，在支架中控制骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)劑的傳遞，以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)足夠的骨生成。最后，促進(jìn)血管形成和血管生成的生長因子也可以用于改善骨再生過程中支架的血管化。

2 3D 打印陶瓷骨組織工程支架

2.1 燒結(jié)3D 打印陶瓷支架

制備陶瓷骨組織支架最常用的方法是打印自定義形狀和孔徑的支架，然后高溫?zé)Y(jié)，去除所有有機相，形成純陶瓷支架。燒結(jié)后可能發(fā)生尺寸收縮，但機械強度和楊氏模量可大大提高。Song 等[13]利用低溫3D 打印+燒結(jié)制備出骨組織工程支架，該支架具有層次多孔結(jié)構(gòu)（支架表面的宏觀孔洞和微孔相互連接）和優(yōu)越的抗壓強度。Chen 等[14]通過3D 打印復(fù)合燒結(jié)工藝構(gòu)建了具有雙重生物活性的鋰鈣硅酸鹽晶體生物載體，用于骨軟骨界面重建，該支架具有較強的機械強度，支持間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和軟骨細(xì)胞在體內(nèi)外的成軟骨分化。

2.2 室溫/低溫3D 打印陶瓷支架

除了高溫?zé)Y(jié)的骨組織工程支架，越來越多的研究者開始使用室溫/低溫的3D 打印方式來制備骨組織工程支架。Song 等[15]研究者報道了采用基于擠壓的低溫3D 打印制備了負(fù)載富血小板纖維蛋白的納米雙相磷酸鈣nBCP/PVA（nBCP∶PVA=84∶16）復(fù)合材料。該支架具有更佳的體外生物相容性和生物活性，改善了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化的問題，并在兔大段骨缺損模型中觀察到更多新骨形成。

2.3 3D 打印陶瓷支架后吸附藥劑

為了進(jìn)一步給生物陶瓷支架提供附加功能，涂層和功能劑的后吸附在內(nèi)的后處理被廣泛采用。Kim 等[16]使用PCL乳液涂層方法將骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）負(fù)載的PLGA 納米顆粒添加到HA 支架表面。BMP-2/PLGA 納米顆粒均勻分布于支架表面，BMP-2 逐漸釋放。此外，PCL 涂層提高了支架的抗壓強度。采用PCL-BMP-2/PLGA 納米顆粒包覆支架，可改善體外細(xì)胞增殖、黏附、成骨分化及體內(nèi)新骨形成。

燒結(jié)的3D 打印陶瓷展現(xiàn)出了優(yōu)越的機械性能，作為骨組織工程的支架，可以更好地支持細(xì)胞的成骨分化和成軟骨分化。室溫/低溫的3D 打印陶瓷支架，使得陶瓷支架更為研究者們所接受，其相對于普通的實驗條件讓更多研究人員能夠在自己的實驗室中就復(fù)現(xiàn)實驗，使得室溫/低溫3D 打印陶瓷支架快速發(fā)展，而在陶瓷支架吸附的藥劑也為研究和應(yīng)用的多樣化提供了更多的可能性。

3 水凝膠骨組織工程支架

3.1 3D 打印水凝膠支架

近年來，由于水凝膠具有原位包封生物分子和細(xì)胞的能力，已被應(yīng)用于基于擠壓的3D 打印技術(shù)制作骨組織工程支架。通過調(diào)節(jié)水凝膠的組成，可以獲得具有不同力學(xué)性能和細(xì)胞反應(yīng)的支架，其中一些具有誘導(dǎo)骨再生的潛力。

Sithole 等[17]使用海藻酸鈉作為打印材料，使其與聚乙烯亞胺溶液相互作用，通過離子鍵形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，制備出聚合物支架。在生物墨水中加入硅膠作為暫時的無機支撐成分，最終增強骨誘導(dǎo)再生。該支架具有較高的抗拉強度，可用于骨組織工程。Gao 等[18]研究者制備了具有梯度組成/結(jié)構(gòu)和優(yōu)異機械強度的水凝膠支架。梯度支架的軟骨層和軟骨下層有明顯的微觀結(jié)構(gòu)、成分和各向異性力學(xué)強度。梯度支架以時空相關(guān)自適應(yīng)方式誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨和成骨分化。此外，在體內(nèi)的研究也證實了它們同時實現(xiàn)新骨形成和軟骨修復(fù)的有效性。Luo 等[19]使用濃縮的海藻酸鹽/明膠溶液作為打印材料，然后在支架表面上均勻沉淀納米磷灰石涂層。該仿生支架材料具有良好的力學(xué)性能，其力學(xué)性能高于人松質(zhì)骨，并具有較強的蛋白質(zhì)吸附能力。沉淀的磷灰石促進(jìn)了支架上大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。

3.2 3D 打印水凝膠細(xì)胞負(fù)載支架

Demirta 等[20]將MC3T3-E1 預(yù)成骨細(xì)胞封裝在殼聚糖和殼聚糖-HA 水凝膠，然后通過3D 打印的方式制備細(xì)胞負(fù)載支架。殼聚糖/殼聚糖-HA 復(fù)合水凝膠中細(xì)胞表達(dá)的早期、晚期成骨標(biāo)志物均達(dá)到峰值。與藻酸鹽基水凝膠相比，殼聚糖基水凝膠具有良好的打印性，可作為制備細(xì)胞負(fù)載水凝膠支架材料，唯一不足的是彈性模量（15 kPa）明顯低于人松質(zhì)骨。Heo 等[21]通過EDC/NHS 偶聯(lián)將骨形成肽與藻酸鹽結(jié)合形成打印材料，并將其打印到混合骨組織工程支架中。體外和體內(nèi)實驗結(jié)果都表明，海藻酸鹽支架為人脂肪源性干細(xì)胞的生長提供了穩(wěn)定的環(huán)境，并能誘導(dǎo)協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)骨再生。隨著研究的深入，細(xì)胞負(fù)載水凝膠支架可以展現(xiàn)出良好的性能，甚至在某些方面更勝一籌，其為成骨及成軟骨分化都提供了一些新的思路和方法。

4 合成/天然高分子骨組織工程支架

4.1 高溫3D 打印（FDM）聚酯骨組織支架

聚酯也是在制作骨組織工程支架廣泛使用的打印材料。由于其操作過程簡單、環(huán)保、成本低廉等優(yōu)點，骨組織工程支架常采用聚乳酸、PLGA、PCL 等生物可降解、生物相容聚酯制成的絲團或球團來制作。Liu 等[22]利用FDM 技術(shù)制備了具有多種大孔結(jié)構(gòu)的PLGA 支架。支架抗壓強度為15～23 MPa，隨著支架孔隙率的增大，抗壓強度降低。由于PLGA 是生物可降解的，其pH、重量殘留和抗壓強度均隨著孵育時間的增加而不同程度下降。PLGA 支架表現(xiàn)出良好的細(xì)胞反應(yīng)，但是由于支架上缺少微孔，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，支架表面只能觀察到有限的細(xì)胞。Nyberg 等[23]使用FDM 技術(shù)制備了TCP/PCL、HA/PCL、Bio-Oss/PCL 和去細(xì)胞骨基質(zhì)dBM/PCL 支架。礦物顆粒的加入并沒有顯著降低支架的壓縮模量，固體塊的壓縮模量為260 MPa，多孔支架的壓縮模量為32～83 MPa。當(dāng)脂肪源基質(zhì)/干細(xì)胞在體外支架上培養(yǎng)時，Ⅰ型膠原蛋白和骨鈣素在Bio-Oss/PCL 和dBM/PCL 中的基因表達(dá)是PCL 的10 倍，這表明與HA/PCL或TCP/PCL 共混物相比，Bio-Oss/PCL 和dBM/PCL 雜化材料更有利于骨愈合應(yīng)用。Neufurth 等[24]將Ca-P 微粒子與比例為2∶1 的PCL 微粒子混合。在PCL 基質(zhì)中添加Ca-P 微粒子不僅可以顯著改善支架的力學(xué)性能，還可以在支架表面顯示更多的活的成骨細(xì)胞，從而提高生物性能。

4.2 高溫3D 打?。‵DM）聚酯骨組織支架后處理

通過FDM 制備的生物可降解高分子支架雖然可以作為骨組織工程支架，但其表面光滑、阻礙細(xì)胞有效附著等缺點仍然存在，需要改進(jìn)這些缺點，所以很多研究者嘗試加上了一些后處理的手段。Wang 等[25]將石墨烯與PCL 高溫共混，通過FDM 制備石墨烯/PCL 支架，以增強其表面親水性和細(xì)胞附著性。原始石墨烯的加入對細(xì)胞活力和增殖有積極的影響。Jang 等[26]通過FDM 制備了PCL 支架，并與BMP-2 和臍帶血清進(jìn)一步吸附，最終被CaCl2交聯(lián)的藻酸鹽層阻斷。雙支架在體外誘導(dǎo)了更高水平的成骨分化和細(xì)胞礦化，在體內(nèi)誘導(dǎo)了新的骨形成。Park 等[27]通過FDM 制備PCL/PEG支架，然后將其從水溶性PEG 中沖洗出來，在螺紋表面形成微孔。PCL 支架的潤濕性得到明顯改善，細(xì)胞增殖也得到了改善。Duan 等[28]也使用選擇性激光燒結(jié)技術(shù)制備Ca-P/PHBV支架，并與肝素進(jìn)一步移植支架表面結(jié)合rhBMP-2，以實現(xiàn)rhBMP-2 的持續(xù)釋放，體內(nèi)外實驗結(jié)果均表明，rhBMP-2 結(jié)合的Ca-P/PHBV 支架可顯著改善成骨。

4.3 室溫/低溫3D 打印合成/天然高分子骨組織工程支架

基于擠壓的室溫或低溫3D打印技術(shù)也是一種先進(jìn)的3D打印技術(shù)，用于制備具有生物分子原位傳遞能力的合成/天然高分子骨組織工程支架。將合成聚酯溶解在1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜等多種有機溶劑中，可以作為打印材料，可裝載大量生物介質(zhì)：生物陶瓷顆粒、藥物和生物分子。通過調(diào)整工藝參數(shù)，可以打印和穩(wěn)定多遞送骨組織工程支架。Kim 等[29]將PCL/DMSO 溶液與阿侖膦酸鹽結(jié)合，通過基于擠出的3D 打印技術(shù)制備出了ALN/PCL 支架。ALN/PCL支架可獲得4 周以上的ALN 持續(xù)釋放，對MG63 細(xì)胞無毒性。ALN/PCL 支架增強了成骨細(xì)胞活性和礦化作用。此外，與單純的PCL 支架相比，ALN/PCL 支架植入大鼠脛骨缺損模型可顯著促進(jìn)骨形成。

4.4 靜電紡絲法制備合成/天然高分子骨組織工程支架

Ristovski 等[30]采用直接寫入近場熔體靜電紡絲法制備了200 層厚的有序支架。獲得了有圖案的微觀結(jié)構(gòu)（纖維間距為1 mm，直徑為40 m），觀察到細(xì)胞在支架中的成功附著還有均質(zhì)細(xì)胞的分布，證明了利用靜電控制制備具有規(guī)則微觀結(jié)構(gòu)的支架的可行性。Qu 等[31]也通過近場靜電紡絲構(gòu)建了用于骨組織工程的微尺度仿生納米HA/PCL 復(fù)合支架。該支架具有基本規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，孔徑為50～100 m，絲徑10 m。MC3T3-E1 細(xì)胞可以附著在纖維表面并隨培養(yǎng)時間的延長而增殖。這些支架在多尺度、多材料水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)骨組織再生。

5 總結(jié)和展望

綜上所述，對于用以上方法制備出的骨組織工程支架，筆者做出如下總結(jié)。以上方法的區(qū)別在于陶瓷骨組織工程支架具有更好的生物相容特性，能夠很好地融入生物體內(nèi)。水凝膠骨組織工程支架則表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能，在臨床實驗中表現(xiàn)得更加優(yōu)異。高分子骨組織工程支架綜合了以上2 種材料的支架良好特性，表現(xiàn)出良好的生物特性的同時也具有優(yōu)異的力學(xué)性能，靜電紡絲的技術(shù)則為構(gòu)建細(xì)胞支架的微觀結(jié)構(gòu)提供了非常有效的手段。這就為更多的高分子骨組織工程支架的研究和應(yīng)用提供了豐富的方式。

目前，3D 打印技術(shù)的飛速發(fā)展使得3D 打印骨組織工程支架在結(jié)構(gòu)仿生和生物分子/藥物控釋方面取得了一定的進(jìn)展。然而多功能骨組織工程支架材料的需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了藥物/生物分子的簡單傳遞，這就促進(jìn)了3D 打印技術(shù)的發(fā)展。未來3D 打印骨組織工程支架技術(shù)將愈發(fā)成熟，擁有巨大的應(yīng)用空間，在臨床實驗以及中發(fā)揮價值，同時也減少了實驗動物的需求；同時用于器官移植和修復(fù)，為患者提供基于個性化的生物組織。例如，研究負(fù)載細(xì)胞的支架遇到的問題：難以實現(xiàn)足夠的機械強度，宏微復(fù)合的微孔結(jié)構(gòu)和難以同時進(jìn)行細(xì)胞/生物分子原位加載功能。另一方面，如血管形成和血管生成這樣的功能，對于支架深層細(xì)胞的長期生存是至關(guān)重要的。與其他組織制作技術(shù)相比，3D 生物打印技術(shù)的優(yōu)勢包括：制作解剖學(xué)上正確的形狀、制作多孔結(jié)構(gòu)、使用多種細(xì)胞類型、控制生長因子和基因的傳遞。而打印技術(shù)的分辨率是需要改進(jìn)的部分，使組織和器官的血管化成為可能。設(shè)計具有仿生特性和良好的骨形成能力的骨組織工程支架，對于由皮質(zhì)骨、松質(zhì)骨和血管組成的復(fù)雜骨組織結(jié)構(gòu)修復(fù)具有重要意義。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，骨科植入物的個性化。對于小尺寸標(biāo)準(zhǔn)植入物或假肢，尤其是用于脊柱，牙齒或顱面疾病的假體，自定義打印3D 對象的成本很低，這將服務(wù)于對于生產(chǎn)量低或生產(chǎn)高度復(fù)雜或需要頻繁修改的零件或產(chǎn)品的公司。我們需要繼續(xù)深入改進(jìn)3D 打印骨組織工程支架，以使骨組織在最佳條件下進(jìn)行再生。