應(yīng)激耐受多系分化細胞治療糖尿病足潰瘍機制的研究進展

羅浩銘，白欽欽，王金晶，賈軍，馬印東，黃國寶

(1.濰坊醫(yī)學院研究生院，山東 濰坊 261053； 2.貴州醫(yī)科大學研究生院，貴陽 550025；3.山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院燒傷整復外科，濟南 250013)

目前我國糖尿病患者數(shù)量龐大，根據(jù)流行病學統(tǒng)計，我國18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%[1]，患病人數(shù)約1.14億，居世界首位[2]，且呈逐年上升趨勢。糖尿病足潰瘍是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，患病率占糖尿病患者的15%～25%[3]。在非創(chuàng)傷性下肢截肢的患者中約85%患有糖尿病足潰瘍[4]，膝蓋以上截肢患者的術(shù)后死亡率與結(jié)腸癌術(shù)后5年死亡率相同，僅次于肺癌[5]。目前糖尿病足潰瘍的整體治療效果不容樂觀。傳統(tǒng)的治療方法包括控制血糖、預(yù)防感染以及足部潰瘍手術(shù)清創(chuàng)。近年來，大量新型技術(shù)被應(yīng)用于臨床，如生長因子及雙層人工真皮的應(yīng)用、負壓吸引術(shù)、高壓氧療法、超聲輔助清創(chuàng)術(shù)等均取得了較好的療效[6-10]。因糖尿病足潰瘍發(fā)病機制復雜多樣，上述方法也存在一定的局限性。近年來，應(yīng)激耐受多系分化細胞(multilineage differentiating stress enduring cell，Muse細胞)的發(fā)現(xiàn)為糖尿病足潰瘍等慢性創(chuàng)面的診療提供了新思路。Muse細胞是存在于間充質(zhì)干細胞中的一類特殊細胞，具有三系分化潛能和多能標志物，在組織修復中具有獨特的優(yōu)勢。Muse細胞在各種動物實驗中均取得了良好的治療效果[11-13]，且避免了傳統(tǒng)手術(shù)的高風險，成為治療糖尿病足潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面的研究熱點。現(xiàn)就Muse細胞治療糖尿病足潰瘍機制的研究進展予以綜述。

1 Muse細胞

1.1Muse細胞的來源與特性 干細胞在現(xiàn)代醫(yī)學中具有重要地位，可能用于治療各種疑難病癥。但干細胞可能具有致瘤和致畸性，且在缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、促炎因子和活性氧類的局部微環(huán)境中存活率極低，所以臨床應(yīng)用受限。2010年Kuroda等[14]首次報道了Muse細胞，他們發(fā)現(xiàn)人類間充質(zhì)干細胞中含有一小部分獨特的多能干細胞子集，在體內(nèi)或體外可分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層3個胚層。該多能干細胞子集在經(jīng)過胰蛋白酶處理8 h或16 h后，直徑>25 μm的大部分細胞表達多能性標記(Nanog基因、Oct3/4基因、特異性胚胎抗原-3和蛋白酶活化受體-4等)。Muse細胞不僅可以自我更新分化，而且高分化率比例可達80%～95%。Ogura等[15]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，Muse細胞具有低端粒酶活性，且在體內(nèi)不具有致瘤性，這使其能相對安全的用于臨床。研究表明，多能干細胞僅由Muse細胞產(chǎn)生，它扮演著間充質(zhì)干細胞和多能干細胞的角色，并且成為多能干細胞的理想來源[16-18]。值得注意的是，Muse細胞通過局部或靜脈注入損傷部位后，在壓力、缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的微環(huán)境中自發(fā)分化為特異性細胞，在體內(nèi)補充缺損丟失的細胞，有助于組織再生和修復。Muse細胞的分離可能對再生醫(yī)學和細胞治療產(chǎn)生重要影響。

1.2Muse細胞的分離 Muse細胞位于除基底膜外幾乎所有器官的結(jié)締組織中，可從間充質(zhì)干細胞、脂肪組織、皮膚纖維細胞和骨髓基質(zhì)細胞中分離，占間充質(zhì)干細胞的1%～6%[14-15]。非Muse細胞不能表達特異性胚胎抗原-3，因此特異性胚胎抗原-3可用于Muse細胞的分離。目前Muse細胞的分離多使用胰蛋白酶分離、磁珠分離或流式分選。此外，Heneidi等[19]利用脂肪抽吸的方法，在細胞嚴重應(yīng)激(長時間蛋白水解酶消化、低溫、血漿缺乏和缺氧)環(huán)境中分離得到脂肪組織來源的Muse細胞，且特異性胚胎抗原-3陽性表達率高達60%[20]。脂肪來源Muse細胞在特異性誘導分化培養(yǎng)基中均能向3種生殖系細胞分化，其中間質(zhì)分化率為82%，內(nèi)胚層分化率為75%，外胚層分化率為78%[19]。與其他幾種方法相比，脂肪抽吸法更快捷、有效，并且在丙烯酸酯/丙烯酰胺聚合物中成簇生長，同時該聚合物能促進未分化狀態(tài)的Muse細胞的黏附、增殖和維持，提高Muse細胞的分離效率[21]。

2 Muse細胞治療糖尿病足潰瘍的機制

目前已有Muse細胞藥物制劑進行臨床藥物試驗，用于觀察治療糖尿病足潰瘍的臨床療效。Muse細胞藥物制劑是通過從活生物體的間充質(zhì)組織或培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞中分離特異性胚胎抗原-3陽性多能干細胞制成的細胞制劑。基于皮膚組織的再生機制，將Muse細胞藥物制劑用于糖尿病足潰瘍受試者足部創(chuàng)面時，Muse細胞可分化為表皮細胞、角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞等構(gòu)成皮膚組織的細胞。Muse細胞恢復組織功能的能力表明其在細胞應(yīng)激和急性損傷有關(guān)的細胞機制中有一定的積極作用[22]。

2.1增加低氧微環(huán)境中生長因子的分泌 糖尿病足潰瘍的愈合是一個復雜的生物學過程，包括一系列交叉級聯(lián)反應(yīng)，如炎癥反應(yīng)、細胞增殖遷移和傷口重塑，且需要各種修復細胞、生長因子和細胞外基質(zhì)的相互協(xié)調(diào)[23]。生長因子是組織修復再生的關(guān)鍵分子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10余種生長因子，涉及并調(diào)節(jié)傷口愈合的各個階段[24]。生長因子具有廣泛的生物學活性，能刺激中胚層和外胚層中的細胞生長和增殖，從而促進毛細血管和神經(jīng)組織再生，同時其還能刺激上皮細胞和內(nèi)皮細胞增殖，以及促進潰瘍?nèi)庋拷M織增生[25]。糖尿病足潰瘍由于血管病變，長期處于低灌注狀態(tài)而導致組織嚴重缺氧。生長因子在組織修復中起重要作用，但在缺血缺氧的潰瘍創(chuàng)面中含量較低。從糖尿病足潰瘍組織中分離出的角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞增殖潛能較低，且生長因子水平低于正常組織[26]。Bauer等[11]研究發(fā)現(xiàn)在干細胞治療肢端缺血過程中，僅有極少部分干細胞能夠遷移至缺血性創(chuàng)面，這部分干細胞極有可能是Muse細胞。有動物實驗將鏈脲佐菌素注射于小鼠腹腔內(nèi)破壞胰島β細胞，制作糖尿病小鼠模型。小鼠血糖達標后，在背部用打孔器打孔并將Muse細胞注射在傷口周圍的四個點，此后連續(xù)記錄傷口的愈合情況。結(jié)果顯示，在相同氧含量下Muse細胞組的傷口愈合時間短于對照組，在低氧環(huán)境(1% O2)中表皮生長因子、血小板源性生長因子、神經(jīng)生長因子、干細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β表達上調(diào)，表明血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β和堿性成纖維細胞生長因子參與傷口愈合的初始凝結(jié)階段[27]。同時，轉(zhuǎn)化生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對干細胞的增殖有促進作用，這形成了一個良性循環(huán)，可更好地促進傷口愈合。Muse細胞促進傷口愈合的機制尚待進一步闡明，在低氧條件下分泌大量生長因子可能是其加速皮膚修復過程的重要原因之一。

2.2促進上皮和肉芽組織生成 在糖尿病足潰瘍的修復過程中，成纖維細胞遷移至創(chuàng)面，與創(chuàng)面新生的毛細血管形成肉芽組織來修補缺失的組織。同時，角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞從創(chuàng)面邊緣通過遷移、增殖和分化三個階段逐步封閉創(chuàng)面。Muse細胞可在肉芽組織生成和再上皮化中發(fā)揮獨特優(yōu)勢。Rogers等[13]將骨髓源性干細胞應(yīng)用于3例糖尿病足潰瘍患者的足部創(chuàng)面，13 d后所有患者創(chuàng)面均長出了肉芽組織，再配合使用皮膚移植物，傷口愈合時間明顯縮短。Muse細胞在整合到糖尿病小鼠的缺損皮膚后，可分化為真皮成纖維細胞和毛細血管，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白4因子的作用下還能分化為角質(zhì)形成細胞，從而修復皮膚組織[28-29]。Takeshi等[30]用轉(zhuǎn)化生長因子-β2和抗壞血酸將Muse細胞培養(yǎng)2周后，觀察到成纖維細胞標志物，如Ⅰ型和Ⅳ型膠原復合物。Ⅳ型膠原復合物的端粒酶活性低于人原代成纖維細胞，表明Muse細胞可生成功能性成纖維細胞，而無需任何外部基因轉(zhuǎn)導。Muse細胞還可產(chǎn)生細胞外基質(zhì)蛋白，保護細胞免受有害環(huán)境的侵害，以幫助傷口愈合，并增強新組織的再生。在促進上皮再生的同時，Muse細胞可根據(jù)其抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能對上皮細胞發(fā)揮保護作用[31]。深度創(chuàng)面的愈合周期較長，面積大于3 cm×3 cm且傷及皮膚全層的深度創(chuàng)面通常無法自愈，需手術(shù)覆蓋創(chuàng)面。Muse細胞的應(yīng)用則可加快角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的遷移速度，最大限度地減輕患者的痛苦。

2.3抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用 糖尿病足潰瘍創(chuàng)面覆蓋大量壞死組織，同時還伴隨著巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞及各種炎癥因子的浸潤。足部破潰創(chuàng)面長期不愈合，炎癥由急性轉(zhuǎn)為慢性，細菌也可從局部定植進展為全身感染。慢性炎癥的發(fā)生大大延長了糖尿病足潰瘍的愈合時間，增加了治療難度和患者風險。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，研究發(fā)現(xiàn)，當受損的胰島β細胞產(chǎn)生的自身抗原被抗原呈遞細胞識別并激活促炎反應(yīng)時，Muse細胞可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)從而維持胰島β細胞的功能，使胰島β細胞能夠相對穩(wěn)定地分泌胰島素來控制血糖[32]。Muse細胞可通過激活蛋白激酶A信號轉(zhuǎn)導通路、法尼醇X受體/視黃醇X受體和肝X受體/視黃醇X受體途徑的蛋白質(zhì)受體來調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[33]。此外，Muse細胞還能產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)，包括血紅素加氧酶-1、吲哚胺-2，3-雙加氧酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和一氧化氮。T細胞和巨噬細胞分泌的γ干擾素和腫瘤壞死因子-α可加重局部炎癥反應(yīng)，而Muse細胞可通過減少T細胞和巨噬細胞的分泌而減少促炎因子的產(chǎn)生。Perone等[32]在脂多糖刺激實驗中發(fā)現(xiàn)，脂多糖可顯著誘導RAW264.7細胞分泌腫瘤壞死因子-α，然而在Muse細胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-α分泌減少。Sun等[31]研究證實，Muse細胞具有分泌抗炎細胞因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素-10和補體C3)并拮抗其免疫調(diào)節(jié)的功能，還能減少促炎因子(白細胞介素-6、γ干擾素)的分泌[34-35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Muse細胞能直接減輕炎癥反應(yīng)[23]。由此可見，Muse細胞可最大限度地調(diào)節(jié)局部炎癥因子的分泌、抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫功能，進而加速潰瘍愈合。

2.4定向分化潛能 再生醫(yī)學的目標是通過補充丟失的細胞來恢復缺損組織結(jié)構(gòu)和功能。糖尿病足潰瘍患者常并發(fā)周圍神經(jīng)血管病變，可發(fā)生皮膚淺表潰瘍、脂肪肌肉壞死、深部潰瘍甚至發(fā)生骨髓炎及全足壞疽而導致截肢。臨床上通常需要對糖尿病足患者進行無創(chuàng)動脈評估(如經(jīng)皮氧分壓測定、踝/肱指數(shù)、階段性多普勒測壓)和下肢感覺的評估來判斷嚴重程度，足部潰瘍組織缺損的程度也被作為糖尿病足潰瘍分級的標準之一[36]。Muse細胞能較敏感地接收受損組織的信號，并在損傷部位定向分化為相應(yīng)缺損的細胞促進組織修復。在不同動物疾病模型(如急性重型肝炎、肌肉變性、皮膚潰瘍、肝硬化、腦卒中、白癜風和局灶性節(jié)段性腎小球硬化)中，Muse細胞能有效地進入受損組織并分化為特定的細胞，促進組織再生和功能恢復[37]。如在急性重型肝炎動物模型中，將帶有熒光標記的Muse細胞注射到急性重型肝炎小鼠的肝和肌肉中，這些Muse細胞可整合和自發(fā)分化為肝細胞和骨骼肌細胞來修復缺失組織；同時，可觀察到Muse細胞迅速分化為真皮成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和角質(zhì)形成細胞等，在微濕微酸等適宜的微環(huán)境下其修復皮膚組織缺損的效果更佳[17]。Muse細胞作為多能干細胞的理想來源，可在糖尿病足潰瘍處分化為多種缺失細胞以修復缺損組織。

2.5其他機制 Muse細胞還有多種機制協(xié)同促進糖尿病足潰瘍的愈合。在分子層面上，如通過堿基對切除修復和核苷酸切除修復來修復DNA[38]，在過氧化氫和紫外線照射的環(huán)境下，Muse細胞的衰老和凋亡水平均低于非Muse細胞，這與損傷后DNA損傷修復系統(tǒng)被激活有關(guān)[29]。在細胞層面上，Muse細胞可修復成纖維細胞的表觀遺傳特征和細胞功能，使成纖維細胞加速遷移、增生，從而加速潰瘍愈合[39]。在一項糖尿病小鼠實驗中，Muse細胞組小鼠腹腔內(nèi)注射Muse細胞，對照組小鼠腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液，1周后生理鹽水組平均血糖>27.8 mmol/L，而Muse細胞組在觀察的7周內(nèi)血糖水平為11.2～27.8 mmol/L，且Muse細胞組7周內(nèi)體重保持穩(wěn)定[31]。由此可見，全身用藥不僅可修復局部潰瘍創(chuàng)面，穩(wěn)定胰島素功能，還能保持體重，降低并發(fā)癥的發(fā)生風險。

3 小 結(jié)

Muse細胞可通過多種機制實現(xiàn)組織再生，具有較好的應(yīng)用前景。Muse細胞除用于糖尿病足潰瘍等慢性創(chuàng)面的愈合外，還可用于脊髓損傷、燒傷、慢性腎臟病等疾病的治療。盡管大量證據(jù)表明Muse細胞是一種獨特的具有再生潛能的多能非致瘤性干細胞，但臨床研究較少，仍以動物實驗為主。目前用于研究的Muse細胞多源于幾種間充質(zhì)干細胞，這些間充質(zhì)干細胞可以在不同的小鼠動物模型中促進受損組織再生。Muse細胞在組織修復中具有獨特優(yōu)勢，但應(yīng)用于臨床仍面臨巨大挑戰(zhàn)。如何獲得大量純化的Muse細胞以及提高細胞存活率有待進一步研究，此外，其安全性尚需臨床觀察證實。