活性氧對(duì)胚胎發(fā)育的影響

李曉娜，張振剛，馬學(xué)工，李斌業(yè)

（青海省人民醫(yī)院生殖中心，青海 西寧 810007）

不孕不育癥已日漸成為影響健康的普遍性問(wèn)題，且發(fā)達(dá)國(guó)家及發(fā)展中國(guó)家不孕不育癥患病率均持續(xù)上升，其與性傳播疾病增加、肥胖、婚育年齡延遲等因素密切相關(guān)。輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）日漸成熟，現(xiàn)已成為治療不孕不育的主要方法。影響體外胚胎質(zhì)量的因素如遺傳因素、胚胎環(huán)境（pH、滲透壓、溫度以及氣體組成等）、卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）等，可能導(dǎo)致胚胎細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)發(fā)育不平衡，最終影響胚胎質(zhì)量、移植率以及妊娠率等[1-3]?；钚匝酰╮eactive oxygen species,ROS）是細(xì)胞代謝的正常產(chǎn)物，但是過(guò)度的ROS 則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，如DNA損傷、線粒體功能障礙、脂質(zhì)過(guò)氧化的蛋白質(zhì)氧化修飾等，從而使卵母細(xì)胞細(xì)胞惡化，最終影響其正常發(fā)育[4，5]。卵母細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生ROS，而體外培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)有很多人為因素的干預(yù)，如燈光、機(jī)械處理、空氣等都會(huì)產(chǎn)生額外的ROS。研究發(fā)現(xiàn)[4]，與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞相比，體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞更容易受到氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。此外，姜薇等[6]研究表明，抗氧化劑可以與氧自由基結(jié)合，可抑制自由基鏈的起始增殖，減輕氧化應(yīng)激損傷，消除ROS 對(duì)胚胎造成的影響，進(jìn)而提高體外培養(yǎng)中卵母細(xì)胞的質(zhì)量。本文就ROS 對(duì)胚胎的影響機(jī)制及減輕ROS 對(duì)胚胎損傷的方法作一綜述，以期為提高臨床妊娠率提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 ROS 對(duì)胚胎的影響機(jī)制

機(jī)體在正常生理?xiàng)l件下氧化防御系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)不能有效地中和組織和細(xì)胞所產(chǎn)生的氧化物時(shí)就會(huì)產(chǎn)生所謂的氧化應(yīng)激[7]。研究表明[8]，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致女性不孕不育的重要影響因素，在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生變形甚至凋亡，改變減數(shù)分裂紡錘體，引起脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞膜的選擇性消失，胞質(zhì)酶失去活性和DNA 損傷。ROS 是一種通過(guò)線粒體電子鏈中有氧代謝產(chǎn)生的氧自由基，它是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體激活以及基因表達(dá)等機(jī)制的重要參與者，適量的ROS 可以維持卵母細(xì)胞的正常生理狀態(tài)，而過(guò)量的ROS 會(huì)產(chǎn)生氧的毒性代謝離子，如過(guò)氧根離子（O2-）和氫氧根離子（OH-），使得卵母細(xì)胞膜發(fā)生組成發(fā)生改變，膜的不穩(wěn)定性和卵母細(xì)胞卵裂異常，引起胚胎發(fā)育中正常所需物質(zhì)發(fā)生變化，最終使得胚胎發(fā)育停滯甚至死亡[9，10]。ROS 通過(guò)不同的信號(hào)通路對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不同的影響，具體機(jī)制如下。

1.1 ROS 通過(guò)調(diào)控p53 因子影響胚胎發(fā)育 隨著胚胎冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的生殖中心會(huì)選擇冷凍胚胎來(lái)找尋患者的最佳移植時(shí)期。研究發(fā)現(xiàn)[11]，在凍融胚胎過(guò)程中，胚胎對(duì)ROS 會(huì)產(chǎn)生更高的敏感性，而過(guò)氧化氫（H2O2）作為ROS 的重要組成部分，與P53 有著很大的聯(lián)系。

p53 一直作為“基因衛(wèi)士”被臨床知曉，其是細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)控者。機(jī)體在一定條件下p53 才會(huì)被激活，如機(jī)體滲透壓發(fā)生改變、氧化應(yīng)激狀態(tài)以及紫外線照射等。研究發(fā)現(xiàn)[12]，在敲除p53 的小鼠模型中，其卵母細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)分裂異常和受精率降低等現(xiàn)象，它可以在胚胎的配子發(fā)生有絲分裂時(shí)保護(hù)遺傳的穩(wěn)定性。井洋洋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)H2O2處理后，胚胎中的p53 基因mRNA 表達(dá)量明顯高于對(duì)照組；GADD45 作為p53 基因大的下游基因，同樣經(jīng)過(guò)H2O2干預(yù)后，其表達(dá)量也明顯高于對(duì)照組；當(dāng)添加了抗氧化劑時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53 表達(dá)量有明顯的下降，且伴隨著ROS 表達(dá)量減少，p53 基因mRNA含量也會(huì)出現(xiàn)下降，說(shuō)明ROS 引起的氧化應(yīng)激可能會(huì)通過(guò)影響p53 表達(dá)量對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，由此可以進(jìn)一步推測(cè)在胚胎處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)。同時(shí)，p53 也可以通過(guò)調(diào)控GADD45 等下游基因來(lái)修復(fù)細(xì)胞損傷，保證胚胎染色體穩(wěn)定性，最終確保胚胎的遺傳完整性。此外，當(dāng)胚胎處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較多的ROS，它能夠激活p53 基因，該基因可以通過(guò)調(diào)控其上游或下游基因的表達(dá)量，以此對(duì)胚胎細(xì)胞周期產(chǎn)生影響[14，15]。

1.2 ROS 通過(guò)干預(yù)細(xì)胞自噬影響胚胎發(fā)育 自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的再循環(huán)[16]。機(jī)體在生理或病理情況下，自噬大都會(huì)產(chǎn)生作用，其中卵母細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)和mRNA，在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中，自噬起著尤為重要的作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18]，存在自噬缺陷的胚胎發(fā)育不會(huì)超過(guò)8 細(xì)胞，其機(jī)制可能是胚胎從4 細(xì)胞到8 細(xì)胞過(guò)程中會(huì)進(jìn)行大量的蛋白質(zhì)合成，而自噬缺陷的胚胎新和成蛋白的能力就會(huì)受到抑制，從而影響胚胎的正常發(fā)育。

此外，胚胎在發(fā)育的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，并且有研究發(fā)現(xiàn)[19]，伴隨著ROS 表達(dá)的增多，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ的含量也會(huì)升高，說(shuō)明ROS 與自噬之間存在重要的聯(lián)系，并且能夠誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，其機(jī)制主要有以下幾方面：①ROS 可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)相關(guān)蛋白HMGB1 向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞自噬水平；②ROS 可以通過(guò)激活ClassⅢPI3K/Beclin1 信號(hào)通路，抑制mTOR 和Akt信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)量，從而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生；③p53 靶基因編碼的蛋白能夠誘導(dǎo)凋亡調(diào)控因子（TIGAR）間接的減少ROS 的表達(dá)量，從而阻礙自噬的發(fā)生。由此可以推測(cè)，ROS 可以通過(guò)多條信號(hào)通路對(duì)自噬產(chǎn)生影響，但ROS 究竟是如何通過(guò)自噬作用對(duì)胚胎細(xì)胞產(chǎn)生影響還需要更加深入的研究。

1.3 ROS 與胚胎細(xì)胞凋亡的關(guān)系 細(xì)胞凋亡是一種不可避免的生理現(xiàn)象。細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中會(huì)發(fā)生代謝反應(yīng)，使得衰老的線粒體過(guò)度堆積，隨之產(chǎn)生過(guò)多的ROS，進(jìn)而使得氧化應(yīng)激不斷增強(qiáng)，相反的就會(huì)損傷細(xì)胞線粒體和溶酶體等，激活凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[20]。許鵬宇等[21]通過(guò)對(duì)第3 天廢棄胚胎研究發(fā)現(xiàn)，人類胚胎的碎片率與ROS 表達(dá)量呈正相關(guān)性，此外，將胚胎分別置于5%和20%氧氣環(huán)境下培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，20%氧氣環(huán)境下ROS 的表達(dá)量明顯高于5%氧含量環(huán)境，由此推測(cè)高水平的ROS 可能會(huì)造成胚胎造成損傷，阻礙胚胎正常發(fā)育[22]。胚胎是由精子和卵母細(xì)胞融合而成，精子與卵子之間高效的選擇性保證了胚胎的遺傳性，因此優(yōu)質(zhì)的精子和卵子就顯得尤為重要，趙洪鑫等[23]研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患者精漿ROS 水平較對(duì)照組明顯升高，ROS 水平與精子DFI（DNA 碎片指數(shù)）呈正相關(guān)，表明不育癥男性的精子可發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致精子DNA 碎片增加，這就說(shuō)明了ROS 可引起機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷，可能與精子細(xì)胞膜蛋白質(zhì)受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。

ROS 也可以通過(guò)影響Caspase 凋亡通路對(duì)胚胎發(fā)育造成影響。Caspase 凋亡通路作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中的重要組成部分，ROS 可以通過(guò)內(nèi)外兩條途徑引起細(xì)胞凋亡，過(guò)量的ROS 可以導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，線粒體通透性轉(zhuǎn)化，從而激活Caspase 凋亡通路；外源性途徑主要由于一些死亡受體能夠直接激活Caspase 凋亡通路，使得細(xì)胞發(fā)生凋亡[24]。總之，ROS 可以通過(guò)影響精子的質(zhì)量使得胚胎細(xì)胞發(fā)育停滯甚至凋亡，最終影響胚胎的妊娠率。

2 減輕ROS 對(duì)胚胎損傷的方法

2.1 提高操作熟練技術(shù)，調(diào)整胚胎最適生長(zhǎng)環(huán)境 輔助生育技術(shù)主要是由體外受精胚胎移植技術(shù)（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）和胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）組成，從獲卵到受精，再到胚胎培養(yǎng)，整個(gè)操作過(guò)程都在體外進(jìn)行。影響ROS 表達(dá)量的因素有很多，主要包括體外培養(yǎng)環(huán)境和操作過(guò)程。前期有研究發(fā)現(xiàn)[25]，胚胎在20%氧含量培養(yǎng)后ROS 的表達(dá)量明顯高于5%氧培養(yǎng)，傳統(tǒng)的胚胎評(píng)分方法需要頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱，ROS 的表達(dá)量就會(huì)增多，從而使得胚胎生長(zhǎng)沒有一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，因此延遲攝像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，應(yīng)用該技術(shù)動(dòng)態(tài)評(píng)估胚胎生長(zhǎng)過(guò)程，可以大大減輕氧化應(yīng)激對(duì)胚胎影響，從而提高胚胎的利用率。

此外，在體外培養(yǎng)的操作過(guò)程中，比如胚胎的觀察、冷凍以及解凍等，由于受到個(gè)人技術(shù)的熟練程度影響，也會(huì)產(chǎn)生不同程度的ROS，這就需要每一位胚胎學(xué)家能夠熟練掌握胚胎學(xué)操作技術(shù)，爭(zhēng)取在最短的時(shí)間內(nèi)，完成整個(gè)操作過(guò)程，減少ROS 的表達(dá)量，減輕對(duì)胚胎的損傷，提高胚胎質(zhì)量。

2.2 生物抗氧化劑干預(yù) ROS 表達(dá)量直接影響胚胎的發(fā)育，為了減輕這種損傷作用，研究發(fā)現(xiàn)[26]，一些生物抗氧化劑能夠抑制ROS 活性，如氮-乙酰半胱氨酸（NAC）、維生素（Vc）、維生素B5（VB5）以及迷迭香酸等。NAC 是一種常見的抗氧化劑，能夠直接與ROS 的代謝離子反應(yīng)，還可以通過(guò)脫乙?；饔棉D(zhuǎn)化為谷胱甘肽（GSH），其是重要的抗氧化劑能夠清除ROS 等自由基，減少氧化應(yīng)激損傷；且有研究發(fā)現(xiàn)[27]，當(dāng)其濃度為1 mmol/L 時(shí)，胚胎形成囊胚率最高，抗氧效果最佳。Vc 即所謂的L-抗壞血酸性，具有很強(qiáng)的抗氧化性，能夠迅速清除細(xì)胞在新陳代謝中產(chǎn)生的一系列氧自由基，與其他的抗氧化劑相比較，它可以與ROS 迅速反應(yīng)，使胚胎內(nèi)的低分子量抗氧化劑含量恢復(fù)到正常水平，增強(qiáng)其抗氧化作用；VB5作為輔酶A 生物合成所必須的維生素，廣泛存在于各種生命組織中，它可以通過(guò)促進(jìn)脂肪酸代謝來(lái)消除脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻止ROS 進(jìn)入胚胎，以此減輕氧化應(yīng)激對(duì)胚胎的損傷[28]。研究發(fā)現(xiàn)[29]，迷迭香酸（RA）可以有效減輕氧化應(yīng)激對(duì)豬卵母細(xì)胞的損傷，其抗氧化機(jī)制可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，其中羧酸基團(tuán)與芳香環(huán)中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)共同作用中和自由基。另有研究表明[30]，RA 可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平來(lái)抑制H2O2誘導(dǎo)的N2A 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，此外，RA 也有效地減弱β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和減少PC12 細(xì)胞中ROS 的積累。

3 總結(jié)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，不孕不育已經(jīng)成為大家所關(guān)注的焦點(diǎn)，輔助生育技術(shù)也因此被大家提出，成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，在其發(fā)展的過(guò)程中，越來(lái)越多的問(wèn)題引起了科研工作者的關(guān)注。影響此項(xiàng)技術(shù)的因素有很多，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)貫穿于整個(gè)胚胎的發(fā)育過(guò)程中。但至今為止，氧化應(yīng)激對(duì)胚胎的影響機(jī)制尚未明確，應(yīng)用不同的干預(yù)措施，盡可能的減少氧化應(yīng)激對(duì)胚胎的損傷作用，可為輔助生育技術(shù)提供更有利的幫助。