口腔白色念珠菌生物膜的形成、體內(nèi)模型及耐藥機(jī)制

郝偉鋒 張荷鈺 葛學(xué)軍

作者單位：030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院[郝偉鋒、葛學(xué)軍（葛學(xué)軍為通訊作者）]；北京大學(xué)口腔醫(yī)院·中心實(shí)驗(yàn)室（張荷鈺為共同通訊作者）

白色念珠菌是口腔中常見的共生菌，在維持口腔生態(tài)系和宿主之間的平衡發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體內(nèi)平衡被某些因素破壞后，白色念珠菌由共生菌轉(zhuǎn)為致病菌，尤其容易感染免疫力低下、黏膜完整性破壞及老年患者[1]。常用的抗真菌藥物有唑類、多烯類、棘白菌素類與嘧啶類，但由于其廣泛使用導(dǎo)致耐藥性問題益發(fā)嚴(yán)重。本文就口腔白色念珠菌生物膜形成過程、體內(nèi)研究模型、抗真菌藥物及耐藥機(jī)制作一簡要綜述，。

一、生物膜形成過程及體內(nèi)模型研究

生物膜是由自身產(chǎn)生的大量細(xì)胞外基質(zhì)包裹、附著于生物材料或人體組織表面的有組織的細(xì)胞群落[1，2]。白色念珠菌生物膜的形成過程為：①早期（0～11h）：0～2h，白色念珠菌主要以酵母相細(xì)胞黏附在生物表面，形成薄細(xì)胞層，細(xì)胞多分散存在；3～4h即有散在的微菌落形成。②中期（12～30h）：白色念珠菌進(jìn)一步生長增殖定植在薄層細(xì)胞層表面，此時(shí)可見大量細(xì)胞外基質(zhì)，游離菌落被基質(zhì)逐漸包裹，聚集形成生物膜的基底層。③晚期（31～72h）：細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步積累，覆蓋在菌落表面直至將細(xì)胞完全包裹，形成由酵母相細(xì)胞、假菌絲細(xì)胞、菌絲細(xì)胞構(gòu)成的成熟三維網(wǎng)狀生物膜。④部分白色念珠菌細(xì)胞從生物膜分離擴(kuò)散到新的生物表面，促進(jìn)遠(yuǎn)端部位的定植和建立新的感染部位[3，4]。由蛋白質(zhì)（55%）、碳水化合物（25%）、脂類（15%）和核酸（5%）組成的細(xì)胞外基質(zhì)為生物膜提供了完整的物理屏障，是成熟生物膜抵抗機(jī)械破壞的關(guān)鍵。菌絲作為支撐生物膜不同成分的支架，促進(jìn)了生物膜結(jié)構(gòu)的整體穩(wěn)定性[5]。

由于口腔白色念珠菌生物膜形成的復(fù)雜性，多種可復(fù)制的體外模型被用來研究生物膜特性。但由于體外模型未能考慮宿主免疫防御、菌群和病原體的相互作用，因此體內(nèi)模型應(yīng)用而生，以便更好的模擬口腔白色念珠菌生物膜的致病情況。

Nett JE等[6]用雄性斯普拉-道來氏（SD）大鼠做義齒模型研究。SD大鼠在感染當(dāng)天用單劑量的可的松（200mg/kg）進(jìn)行免疫抑制，麻醉后于硬腭處固定8mm×10mm×2mm丙烯酸材料的義齒，并在義齒與硬腭之間留3～5mm間隙以便于接種白色念珠菌（1.0×108細(xì)胞/mL）。待培養(yǎng)不同時(shí)間段后，取出義齒進(jìn)行組織病理學(xué)或形態(tài)學(xué)等檢測。但是由于傳統(tǒng)制作工藝的受限使義齒制作過程費(fèi)時(shí)，對實(shí)驗(yàn)動物損傷大，裝置與硬腭不能緊密貼合。這種情況不能準(zhǔn)確地反映義齒佩戴者的感染發(fā)展過程[7，8]。最近，Sultan等[8]利用牙科三維數(shù)字成像和打印技術(shù)，僅對一只大鼠的上顎進(jìn)行掃描便可精確制作出通用的SD大鼠口內(nèi)裝置，以便更好的研究真菌義齒生物膜感染情況。

Dongari-Bagtzoglou A等[9]以白色念珠菌SC5314感染6～8周齡的雌性C57BL/6小鼠，成功構(gòu)建了口腔黏膜的體內(nèi)模型。小鼠在感染前一天皮下注射醋酸可的松（225mg/kg）抑制免疫功能。麻醉后，用浸有菌液（6.0×108細(xì)胞/mL）的棉球擦拭小鼠口腔，并于舌下放置2h，連續(xù)3天。期間給予動物含有白色念珠菌懸液的飲用水，以保持較高的口腔菌載量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠取出舌頭，在共聚焦顯微鏡下觀察舌頭背面的白色斑塊。最近Martinna等[10]用此模型進(jìn)一步研究了白色念珠菌與口腔各種細(xì)菌的相互作用，并證實(shí)了白色念珠菌在黏膜生態(tài)方面調(diào)控的關(guān)鍵作用。此模型首次對口腔黏膜的白色念珠菌生物膜的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述，為探究白色念珠菌與口腔微生物菌群之間的生態(tài)平衡對真菌感染風(fēng)險(xiǎn)的調(diào)控機(jī)制提供了依據(jù)[9，11]。為了研究發(fā)病機(jī)制，Paolo等[12]對原有模型進(jìn)行改良，使用轉(zhuǎn)基因的生物發(fā)光白色念珠菌對感染進(jìn)程、特定器官靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

二、抗真菌藥物

口腔白色念珠菌感染的有效管理取決于多方面，包括早期的正確發(fā)現(xiàn)與診斷、糾正誘發(fā)因素和潛在疾病、根據(jù)感染嚴(yán)重程度選擇合適的抗真菌藥物[13，14]。但誘發(fā)因素或潛在疾?。ㄈ缙鞴僖浦病滩〉龋┩荒芗皶r(shí)清除，此時(shí)抗真菌藥物治療顯得尤為關(guān)鍵。目前常見的抗真菌藥物根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用靶點(diǎn)可分為四類：抑制細(xì)胞膜成分麥角甾醇的合成（唑類）;改變細(xì)胞膜通透性，細(xì)胞內(nèi)成分喪失（多烯類）;非競爭性抑制β-（1，3）-D-聚糖合酶，阻礙細(xì)胞壁β-（1，3）-D-葡聚糖合成（棘白菌素類）;干擾真菌RNA正常合成及DNA的復(fù)制過程（嘧啶類）。

1.唑類：唑類藥物在口服和靜脈中都具有良好的安全性和生物利用率，是臨床中應(yīng)用最廣泛的抗真菌藥。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成部分，羊毛甾醇在由Erg11調(diào)控的羊毛甾醇14α-去甲基化酶催化作用下生成麥角甾醇維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。唑類藥物通過與羊毛甾醇14α-去甲基化酶（細(xì)胞色素P450酶）的血紅素基團(tuán)中鐵原子高親和力結(jié)合抑制麥角甾醇生成，同時(shí)導(dǎo)致Erg3調(diào)控的毒性的甲基化羊毛固醇增加，從而誘發(fā)膜通透性改變，內(nèi)容物滲透，細(xì)胞死亡[15，16]。常見的唑類藥物有咪唑類（克霉唑、咪康唑）與三唑類（氟康唑、伊曲康唑）。與其他抗真菌藥物相比，咪康唑（貼片、凝膠或爽劑）在治療口腔念珠菌感染，尤其是鵝口瘡具有更低的復(fù)發(fā)率[17]。氟康唑和伊曲康唑則具有更好的藥代動力學(xué)和廣譜抗菌活性，是治療真菌感染的一線藥物，且對艾滋病感染者具有更好的療效[1，13]。但由于唑類藥物典型的抑菌性而非殺菌性，該類藥物的頻繁使用會導(dǎo)致廣泛的耐藥性。妊娠前三個(gè)月口服高劑量氟康唑（＞450mg/d）甚至?xí)黾有律鷥杭∪夤趋阑蔚娘L(fēng)險(xiǎn)[18]。

2.多烯類：多烯類藥物是大環(huán)內(nèi)酯的兩親性有機(jī)天然分子，其通過小分子形式插入細(xì)胞膜與麥角甾醇結(jié)合形成跨膜通道，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子失衡、膜完整性破壞和細(xì)胞死亡[19]。近期，有研究表明多烯類藥物的抗菌機(jī)制為以大的膜外聚集體形式存在，通過提取膜內(nèi)麥角甾醇破壞細(xì)胞膜完整性[20]。局部用藥的制霉菌素不易被胃腸道吸收，因此藥物毒性弱，不良反應(yīng)少，常用于治療黏膜、皮膚、消化道感染[1，21]。兩性霉素B是治療深部危重真菌病的首選藥物，僅供靜脈滴注。由于兩性霉素B特異性差，容易與細(xì)胞膜膽固醇結(jié)合，損傷腎組織。而新研制的脂質(zhì)體包埋的兩性霉素B（L-AmB）與真菌細(xì)胞膜結(jié)合后，外面的脂質(zhì)體才水解，釋放里面的兩性霉素，可高濃度特異性殺滅真菌，降低了對其余組織的毒性損害[1，14]。

棘白菌素類藥物常用于治療侵襲性念珠菌感染，但由于受其大分子結(jié)構(gòu)限制，口服生物利用率低，常需靜脈注射，且成本較高，尚需研發(fā)新的棘白菌素類衍生物[13，22]。嘧啶類藥物常與兩性霉素B或氟康唑聯(lián)合用藥作為輔助治療以減少耐藥問題，但一般不用于初級治療[1，23]。棘白菌素類與嘧啶類藥物由于給藥途徑、藥理作用等方面限制，一般不單獨(dú)用于淺表口腔念珠菌感染的治療，在此不做詳述[14]。

三、生物膜的耐藥機(jī)制

口腔中微生物大部分是以生物膜的形式存在。即使在沒有基因突變的情況下，生物膜黏附于口腔黏膜幾分鐘后便可檢測到耐藥性，而細(xì)胞外基質(zhì)包裹的成熟生物膜更能夠耐受比浮游細(xì)胞高達(dá)1000倍的抗真菌濃度[24]。目前對生物膜的耐藥機(jī)制尚未完全明確，我們將重點(diǎn)介紹這一領(lǐng)域的已有研究結(jié)果和最新進(jìn)展。

1.藥物外排泵：外排泵可增加菌體內(nèi)藥物外排，減少治療藥物在細(xì)胞內(nèi)積累，抵御外界刺激。研究表明唑類耐藥菌株中，外排泵中的ATP能量依賴型結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CDR1和CDR2）和易化載體超家族蛋白（MDR1）等基因往往過度表達(dá)或突變[25，26]。Mukherjee等[27]發(fā)現(xiàn)與親本株相比，敲除了外排泵基因的突變株在生物膜形成早期對藥物敏感性顯著提高。而隨著生物膜的逐漸成熟，兩種菌株對藥物敏感性沒有明顯差異，這可能是由于生物膜生長后期其他耐藥機(jī)制（麥角甾醇含量變化）的增強(qiáng)導(dǎo)致藥物外排泵作用減弱的結(jié)果。CDR1、CDR2和MDR1的過度表達(dá)并沒有影響生物膜對棘白菌素和多烯類藥物的敏感性。Lohberger等[25]的研究證明鋅族轉(zhuǎn)錄因子TAC1、MRR1是外排泵CDR1、CDR2、MDR1等基因的關(guān)鍵調(diào)控因子，突變的轉(zhuǎn)錄因子使外排泵基因表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致早期生物膜耐藥性的產(chǎn)生，但突變?yōu)楹螌χ型砥谏锬び绊戄^小尚未闡述。近年來多種外排泵抑制劑被發(fā)現(xiàn)，為研制新的非外排蛋白底物抗真菌藥物提供了新的思路[28]。

2.持留菌：念珠菌生物膜中的持留菌是在2006年首次發(fā)現(xiàn)的。不同于耐藥菌的基因突變，持留菌是一類能夠在致死劑量依然存活的同基因型、僅表型變異的亞群[29]。當(dāng)抗真菌藥物作用時(shí)，持留菌進(jìn)入增殖緩慢的低活力休眠狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞功能關(guān)閉，藥物作用靶點(diǎn)失效，從而逃避藥物殺傷。藥物濃度代謝降低后，持留菌恢復(fù)其活力，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)[29，30]。持留菌主要在生物膜的初始黏附階段形成，在浮游菌中并未檢測到持留菌[29]。細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄分析顯示，合成持留菌的麥角甾醇（ERG1和ERG25）和β-1，6葡聚糖（SKN1和KRE1）所涉及的基因表達(dá)異常[31]。這些結(jié)果暗示了持留菌的耐藥機(jī)制與細(xì)胞膜、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。目前對持留菌的形成機(jī)制并無定論，但普遍認(rèn)為與營養(yǎng)缺乏、代謝產(chǎn)物堆積、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素有關(guān)[29]。

3.細(xì)胞外基質(zhì)：細(xì)胞外基質(zhì)作為保護(hù)屏障防止抗真菌藥物滲透到目標(biāo)靶點(diǎn)也被認(rèn)為是生物膜耐藥的關(guān)鍵機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)生物膜基質(zhì)中的重要組成成分β-1，3-葡聚糖可優(yōu)先與抗真菌藥物特異性結(jié)合，減少了細(xì)胞壁中β-1，3-葡聚糖的破壞，從而增加白色念珠菌的耐藥性[32]。近期研究了β-1，3-葡聚糖酶的抗生物膜活性，實(shí)驗(yàn)表明其可降解生物膜中的β-1，3-葡聚糖，使基質(zhì)破壞的細(xì)胞對抗真菌藥物的敏感性增加[33]。但β-1，3-葡聚糖酶并不影響浮游菌的生長與黏附，而是通過降低生物膜細(xì)胞的聚集，阻止生物膜的進(jìn)一步形成發(fā)揮作用[33]。除此之外，基質(zhì)中其他組分，如胞外DNA可促進(jìn)不同物種間生物膜的黏附與共聚，而特定的DNA酶在不破壞細(xì)胞膜的情況下干擾生物膜的結(jié)構(gòu)完整性[34，35]。