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    芪黃藥對改善糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制探討*

    2021-11-24 08:38:28李雪瑩何春承許祿華林豐夏趙貝貝
    中醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年11期
    關(guān)鍵詞:黃藥靶點(diǎn)批號

    李雪瑩,何春承,邱 偉,黎 明,許祿華,林豐夏,趙貝貝

    (1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院/深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán)),廣東 深圳 518133;2.深圳恒特醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518000;3.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院,廣東 深圳 518000;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣東 廣州 510006)

    糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是終末期腎臟病的第二位原因,是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。既往研究多認(rèn)為DN的病理改變以腎小球?yàn)橹?,但最新研究發(fā)現(xiàn)以成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為特征的腎間質(zhì)纖維化亦是DN早期重要的病理改變[1-2]。腎間質(zhì)纖維化在慢性腎臟病的進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,但具體發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,臨床尚缺乏有效的治療手段。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的病理基礎(chǔ)以虛為本,以濁瘀為標(biāo),治以益氣降濁為基本大法[3-4],中藥防治DN具有研究前景[5]。本研究團(tuán)隊前期發(fā)現(xiàn),芪黃藥對,即黃芪、大黃組合是益氣降濁法治療慢性腎臟疾病最常用的中藥[6],在延緩慢性腎臟疾病進(jìn)展方面有明確的臨床效果,但目前仍沒有文獻(xiàn)報道芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。因此本研究擬觀察芪黃藥對對糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化及炎癥因子的影響,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討可能的機(jī)制,并進(jìn)行驗(yàn)證。

    1 材 料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡SPF級Wistar雄性大鼠30只,體質(zhì)量約180 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物合格證號:11400700344861。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物飼養(yǎng)室,溫度22~24 ℃,濕度50%~60%,12 h明暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)通過深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán))倫理委員會批準(zhǔn),倫理批件號:2020033102,嚴(yán)格按照相關(guān)條例執(zhí)行。

    1.2 藥物與試劑 道地藥材黃芪(批號:20110105)、大黃(批號:20080312)購自深圳康美藥業(yè)公司;鏈脲佐菌素(批號:09171211)購自瑞士Alexis公司;IL-1β ELISA試劑盒(批號:MM-0922R2)、IL-6 ELISA試劑盒(批號:MM-1011M2)、IL-17 ELISA試劑盒(批號:MM-51291H2)、VEGFA ELISA試劑盒(批號:MM-60042O2)、MAPK ELISA試劑盒(批號:MM-70557R2)、TNF-α ELISA試劑盒(批號:MM-0132M2)均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;α-SMA抗體(批號:GR3241135-2)、山羊抗小鼠抗兔IgG/IgM(批號:GB23303)均購自美國Thermo Fisher公司;血糖監(jiān)測儀(批號:10131214)及血糖試紙(批號:26001921)購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;尿蛋白定量測試盒(批號:AUZ3672)、肌酐測試盒(批號:AUZ3621)、尿素氮測試盒(批號:AUZ3653)均購自深圳愛樂信生物有限公司。

    1.3 主要儀器 代謝籠(意大利TECNIPLAST 公司);SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司);全封閉自動脫水機(jī)、組織包埋機(jī)(深圳達(dá)科為公司);CRYOSTAR NX50型冰凍切片機(jī)(美國Thermo公司);高速冷凍型微量離心機(jī)(美國Thermo公司);BV-2型垂直電泳儀(武漢賽維爾生物科技有限公司);倒置熒光成像分析顯微鏡(奧林巴斯有限公司)。

    2 方 法

    2.1 芪黃藥對提取液制備 根據(jù)文獻(xiàn)方法[7],黃芪、大黃按2∶1比例粉碎,加8倍量60%乙醇-水浸泡30 min,常壓下加熱回流提取3次,每次1 h,濾過合并提取液;減壓回收乙醇,添加蒸餾水,調(diào)pH值至6.5~7.0,并調(diào)整至相當(dāng)于含生藥0.5 g/mL。

    2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測芪黃藥對改善糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn) TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集黃芪、大黃及其化合物成分信息,通過GeneCards獲取腎間質(zhì)纖維化的靶標(biāo)蛋白,所獲得的基因交集使用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫結(jié)合R語言進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。

    2.3 造模與分組 30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取10只作為對照組,予水和普通飼料;剩余20只予高糖高脂飼料,并腹腔注射鏈脲佐菌素(35 mg/kg),造模后監(jiān)測空腹血糖,當(dāng)空腹血糖維持大于16.7 mmol/L時即為造模成功。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組和芪黃藥對組,每組10只。

    2.4 實(shí)驗(yàn)給藥 根據(jù)芪黃藥對成人常規(guī)服用劑量(27 g/d),采用人與大鼠的體表面積換算系數(shù)計算出大鼠的每日給藥劑量為2.8 g/kg,根據(jù)大鼠180 g體質(zhì)量計算為0.51 g生藥;芪黃藥對提取液濃度為0.5 g/mL,因此每日灌胃量為1 mL。芪黃藥對組大鼠每日予以1 mL芪黃藥對提取液灌胃1次,正常組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃,連續(xù)給藥28 d。模型組及芪黃藥對組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng),對照組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)。

    2.5 觀察指標(biāo)

    2.5.1 血尿生化指標(biāo)檢測 大鼠禁食不禁水12 h,取出固定后用剪刀將大鼠尾尖剪去約0.5 cm,將血滴加至血糖試紙上,血糖儀讀取數(shù)值,干棉球擦凈血液并按壓止血。每周測量1次血糖。末次給藥后將大鼠置入代謝籠內(nèi),采集其24 h排泄尿液,計算其24 h尿量并進(jìn)行尿蛋白定量。腹膜內(nèi)注射硫噴妥鈉(200mg/kg)處死大鼠,取全血標(biāo)本,室溫靜置2 h,4 ℃3 000 r/min離心15 min,取上清血清,使用試劑盒檢測肌酐和尿素氮。

    2.5.2 免疫組化染色與分析 將腎臟組織樣品固定在4%多聚甲醛溶液中,冷卻,脫水,石蠟包埋及切片。乙醇脫蠟至水,抗原修復(fù),5%的山羊血清室溫封閉30 min,加入稀釋好的一抗α-SMA(1∶200),4 ℃孵育過夜;PBS洗滌3次后滴加稀釋好的二抗(山羊抗兔/鼠HRP),37 ℃孵育30 min。PBS清洗3次后,DAB避光顯色,鏡下觀察直到棕褐色陽性結(jié)果出現(xiàn)。水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,使用Image J軟件計算每個視野下陽性結(jié)果的積分吸光度和面積。

    2.5.3 腎組織IL-1β、IL-6、IL-17、VEGFA、MAPK、TNF-α水平取腎組織,使用10倍體積PBS冰上研磨,研磨后4 ℃靜置2 h,然后3 000 r/min離心20 min,取上清液。按照試劑盒說明書操作,樣本孔按10∶1比例加上清液,后再以40∶1比例加稀釋液,再分別加入IL-1β、IL-6、IL-17、VEGFA、MAPK、TNF-α抗體;空白對照孔不加任何試劑;酶標(biāo)儀上450 nm處,用空白對照孔為標(biāo)準(zhǔn),測各孔光密度值。每個樣本各5孔,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 使用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn),方差不齊者采用Dunnett’sT3檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié) 果

    3.1 各組大鼠空腹血糖水平比較 與對照組比較,模型組及芪黃藥對組大鼠空腹血糖水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,芪黃藥對組大鼠空腹血糖水平在第14天、第21天明顯降低(P<0.05);第28天空腹血糖水平有所下降,但與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見圖1)

    圖1 各組大鼠空腹血糖水平比較(,n=10)

    3.2 各組大鼠24 h尿蛋白、腎功能比較 與對照組比較,模型組大鼠24 h尿蛋白、肌酐水平、尿素氮水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,芪黃藥對組大鼠24 h尿蛋白、肌酐水平、尿素氮水平均明顯降低(P<0.05)。(見圖2)

    圖2 各組大鼠24 h 尿蛋白、腎功能比較(,n=10)

    3.3 芪黃藥對對糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響 對照組大鼠腎組織α-SMA表達(dá)不明顯;模型組大鼠α-SMA在腎間質(zhì)中明顯表達(dá),見大量深棕黃色物質(zhì);芪黃藥對組大鼠腎間質(zhì)的α-SMA表達(dá)明顯減少。(見圖3)

    圖3 各組大鼠腎組織α-SMA 表達(dá)情況(免疫組化)

    與對照組比較,模型組大鼠α-SMA表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組比較,芪黃藥對組大鼠α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。(見圖4)

    圖4 各組大鼠腎組織α-SMA 表達(dá)情況比較(,n=10)

    3.4 芪黃藥對靶標(biāo)及腎間質(zhì)纖維化靶基因篩選與交集 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選黃芪及大黃相關(guān)有效化合物和作用靶點(diǎn)。逐一對應(yīng)有效成分和靶點(diǎn)的對應(yīng)關(guān)系,刪除重復(fù)靶點(diǎn),并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成Gene Symbol后,共得到芪黃藥對的有效化合物24個,對應(yīng)靶點(diǎn)102個。以“Diabetic Nephropathy”為關(guān)鍵詞,分別從GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫獲得2 974、251、19個靶點(diǎn),篩查重復(fù)值后得到3 149個靶點(diǎn);以“Renal tubular fibrosis”為關(guān)鍵詞,分別從GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫獲得3 344、207、0個靶點(diǎn),篩查重復(fù)靶點(diǎn)后得到3 511個靶點(diǎn),兩者分別匯總再取交集,共得到4 976個DN腎間質(zhì)纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。兩者交集獲得芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的可能作用靶點(diǎn)55個,對應(yīng)有效化合物22個,其中大黃7個,黃芪15個,利用Cytoscape軟件構(gòu)建芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的“有效成分-作用靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò),見圖5。其中,各化合物連接度的平均值為7.8,中位數(shù)為4。度值最高的為槲皮素(quercetin),其余依次為山柰酚(kaempferol)、異鼠李亭(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)和芒柄花黃素(formononetin)等,度值排名前10的化合物信息見表1。這些度值較高的化合物可能是芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵化合物。

    表1 芪黃藥對改善DN 的關(guān)鍵化合物

    圖5 芪黃藥對治療DN 腎間質(zhì)纖維化的“有效化合物-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

    3.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn) 將上述獲得的芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的55個作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,然后使用Cytosacpe軟件對其進(jìn)行優(yōu)化,得到最終的芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖6。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示,網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的連接度中位數(shù)為19.3,節(jié)點(diǎn)介度中位數(shù)為1.31×10-2,節(jié)點(diǎn)緊密度中位數(shù)為0.602,其中連接度、介度、緊密度均超過中位數(shù)的靶點(diǎn)有14個(見表2),推測這些靶點(diǎn)可能是芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

    表2 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)

    圖6 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的PPI 圖

    3.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的功能和通路分析結(jié)果 根據(jù)GO和KEGG分析結(jié)果確定芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化功能及作用機(jī)制,以分析芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的可能途徑。GO分析獲得209個生物學(xué)功能,其中60條有顯著意義(P<0.01),KEGG分析獲得88條通路,其中65條有顯著意義(P<0.01)。根據(jù)P由低到高,分別選取排名前20者,繪制芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化作用靶標(biāo)的GO功能分析和KEGG通路富集分析結(jié)果的氣泡圖,見圖7~8。其中排序越靠前,提示越可能是芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的主要生物學(xué)功能和作用機(jī)制。

    芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化作用靶標(biāo)的GO功能分析主要富集在炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路、細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程、平滑肌細(xì)胞遷移、巨噬細(xì)胞分化、成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控和正調(diào)控胰島素樣生長因子受體信號通路等生物學(xué)功能。(見圖7)

    圖7 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的GO 功能分析結(jié)果

    芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化作用靶標(biāo)的KEGG通路富集分析主要富集在炎癥反應(yīng),液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化,腫瘤壞死因子信號通路,細(xì)胞凋亡,松弛素信號通路,HIF-1信號通路,MAPK信號通路,IL-17信號通路,NF-κB信號通路,p53信號通路和VEGF信號通路等相關(guān)通路。(見圖8)

    圖8 芪黃藥對改善DN 腎間質(zhì)纖維化作用靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析結(jié)果

    3.7 ELISA驗(yàn)證芪黃藥對對預(yù)測靶標(biāo)的影響 對預(yù)測的IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8靶標(biāo)及炎癥因子IL-1β、IL-17進(jìn)行ELISA驗(yàn)證。與對照組比較,模型組大鼠腎組織中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17水平均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,芪黃藥對組大鼠腎組織中VEGFA、MAPK8、IL-1β、IL-6、IL-17水平均明顯降低(P<0.05),而CASP3水平與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見圖9)

    圖9 各組大鼠腎組織中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17 水平比較(,n=10)

    4 討 論

    糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病,臨床上可引起各系統(tǒng)重要臟器的嚴(yán)重并發(fā)癥,而DN是其最常見且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一。在西方國家,DN是終末期腎病的最主要病因,有將近40%的慢性腎衰由DN引起;而在我國,DN則是高達(dá)13.5%患者接受血液透析治療的原因[8],此外它的發(fā)病率還在不斷增加[9]。因此如何有效預(yù)防DN發(fā)生并減慢其發(fā)展進(jìn)度,是目前內(nèi)分泌醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的熱門課題。然而盡管對DN發(fā)病機(jī)制的研究深度不斷增加,但有關(guān)DN臨床治療的研究進(jìn)展仍停滯不前?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是通過血壓控制、糖脂代謝控制及低蛋白飲食方案等對癥治療DN。近年來單純或聯(lián)合使用ACEI、ARB以減輕蛋白尿減少腎臟損傷亦取得一定臨床療效[10],但仍有很大局限性。至今還未發(fā)現(xiàn)可以阻斷DN進(jìn)展的藥物,病情發(fā)展至腎功能衰竭階段時,只能采取腎臟替代治療維持生命。因此,尋找能改善DN的有效且安全的藥物具有重要意義。

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN的發(fā)展過程包括腎小球高濾過、蛋白尿進(jìn)展,然后是腎小球?yàn)V過率下降,最終發(fā)展為終末期腎病,其對應(yīng)的病理表現(xiàn)包括腎小球肥厚、腎小球硬化、腎間質(zhì)炎癥和纖維化[11]。既往大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DN是一種腎小球疾病,而腎間質(zhì)炎癥和纖維化通常被認(rèn)為是DN后期階段才會發(fā)生的病理改變。因此,以往對DN發(fā)病機(jī)制的研究大多圍繞腎小球進(jìn)行,而對體積占到整個腎臟體積90%的腎間質(zhì)的研究[12]則較少。但近年來的許多研究表明,即便是在DN早期,腎間質(zhì)病變也可獨(dú)立并早于腎小球損傷發(fā)生。有研究[13-14]分析了2型糖尿病的DN患者早期階段的腎臟結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示僅有30%患者表現(xiàn)為典型的糖尿病腎小球病變,而40%的患者患有更嚴(yán)重的腎間質(zhì)和(或)血管病變。并且,腎間質(zhì)病變不僅可能比腎小球損傷提前發(fā)生,其病變程度甚至可能決定了DN患者腎臟功能損傷的程度[15]。因此,腎間質(zhì)纖維化是DN重要的病理改變,延緩乃至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對改善DN預(yù)后至關(guān)重要。

    中醫(yī)學(xué)沒有關(guān)于DN的病名記載及相關(guān)專著,但根據(jù)其臨床表現(xiàn),DN屬中醫(yī)學(xué)“腎消”“虛勞”“水腫”“關(guān)格”等范疇。早在東漢張仲景的《金匱要略》就有相關(guān)論述:“小便不利者,有水氣,其人若渴,用栝蔞瞿麥丸主之”。又如《圣濟(jì)總錄》中所言:“消渴病久,腎氣受傷,腎主水,腎氣虛衰,氣化失常,開合不利,水液聚于體內(nèi)而出現(xiàn)水種”,認(rèn)為DN是腎氣虛衰,氣化失常開闔不利所致。而現(xiàn)代中醫(yī)對DN的辨證論治已基本趨于統(tǒng)一,認(rèn)為其證候本質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí),即以虛為本,濁瘀為標(biāo)[3-4]。一方面,DN患者多有氣虛的證候特點(diǎn),病位多在脾腎。脾虛則無力運(yùn)化水液,水液停聚成痰濁濕邪,阻礙氣機(jī)升降而出現(xiàn)嘔吐,濕邪外犯肌膚而出現(xiàn)浮腫、皮膚瘙癢;腎氣不足,膀胱氣化不利則有癃閉、蛋白尿等表現(xiàn),DN患者多有倦怠乏力、氣短懶言、腰膝酸軟等脾腎虛衰的表現(xiàn)。另一方面,痰濁瘀阻血脈則出現(xiàn)高血壓,瘀阻心脈則出現(xiàn)心悸。濁瘀積久,因?qū)嵵绿摚膿p精血,形成惡性循環(huán)。這也和中醫(yī)“久病入絡(luò)”“久病必虛”“水停則血瘀,血瘀則水?!钡鹊睦碚摬恢\而合??傮w而言,DN早期患者多缺乏特異性癥狀,中期患者普遍出現(xiàn)乏力、腰酸、浮腫等癥狀,晚期患者癥狀錯綜復(fù)雜。現(xiàn)代中醫(yī)藥臨床研究學(xué)者開展了大量關(guān)于DN的中醫(yī)臨床研究[16-19],結(jié)果顯示,中醫(yī)藥不僅可以改善DN患者的臨床癥狀,還能減少尿蛋白排泄、改善腎功能,并且能提高DN患者的生存質(zhì)量。

    而在中醫(yī)學(xué)使用益氣降濁法治療DN的藥物中,芪黃藥對,即黃芪、大黃是使用頻率最高且最具代表性的中藥[6]。黃芪具有補(bǔ)氣固表、利水消腫、托毒排膿等功效,大黃具有瀉熱通腑、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效,兩者一補(bǔ)一瀉,與糖尿病腎病以虛為本、以濁瘀為標(biāo)的病機(jī)對應(yīng)。近年來多項體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明,黃芪、大黃對DN腎間質(zhì)纖維化有顯著的保護(hù)作用。如黃芪多糖為中藥黃芪的有效成分之一,具有抗應(yīng)激、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。黃芪多糖可以負(fù)性調(diào)控腎間質(zhì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,減輕腎間質(zhì)纖維化[20];下調(diào)NF-κB、MCP-1表達(dá),從而降低24 h尿蛋白、NAG,保護(hù)腎間質(zhì)[21];下調(diào)TGF-β1的表達(dá),保護(hù)足細(xì)胞,減輕腎臟肥大[22]。氧化應(yīng)激(oxidative stress)學(xué)說是目前最重要的DN發(fā)病機(jī)制相關(guān)學(xué)說之一[23],腎間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中有非常重要的地位[24],而黃芪多糖具有抗氧化應(yīng)激的作用[25]。大黃酸(Rhein)屬于大黃蒽醌衍生物中的一種,可以通過抑制TGF-β誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增生、腎臟固有細(xì)胞肥大及細(xì)胞外基質(zhì)堆積,抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá),抑制成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[26-27],大黃制劑可通過AKI信號通路抑制氧化應(yīng)激等[28]達(dá)到對DN腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用。

    本研究采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠模型觀察了芪黃藥對對糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化及炎癥因子的影響。結(jié)果顯示,芪黃藥對能有效降低糖尿病腎病模型大鼠的24 h尿蛋白、肌酐和尿素氮水平。但芪黃藥對對大鼠空腹血糖影響不明顯,這表明芪黃藥對改善糖尿病腎病大鼠腎功能的機(jī)制并非直接控制血糖。α-SMA是肌成纖維母細(xì)胞的標(biāo)記分子,α-SMA表達(dá)增加是腎間質(zhì)纖維化的重要標(biāo)志[29]。免疫組化結(jié)果表明,α-SMA在模型組大鼠腎間質(zhì)中顯著表達(dá),芪黃藥對能有效降低糖尿病腎病模型大鼠腎間質(zhì)的α-SMA表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)證明芪黃藥對可以減輕糖尿病腎間質(zhì)纖維化。

    以往對芪黃藥對改善DN腎間質(zhì)纖維化的研究多專注于單藥或某化合物的改善機(jī)制,而缺乏整體性、系統(tǒng)性。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)虛擬模擬的方法,系統(tǒng)地探討了芪黃藥對改善DN改善腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,芪黃藥對可以通過槲皮素、山柰酚、異鼠李亭、蘆薈大黃素、芒柄花黃素等有效成分,作用于IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、ERBB2、PPARG、NOS3等靶點(diǎn),通過影響TNF、松弛素、HIF-1、MAPK、IL-17、NF-κB、p53、VEGF等信號通路,發(fā)揮改善DN腎間質(zhì)的血流動力學(xué)狀態(tài)、糖脂代謝、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程的作用,進(jìn)而改善DN腎間質(zhì)纖維化。因此,本研究進(jìn)一步采用ELISA檢測腎臟組織中預(yù)測關(guān)聯(lián)度最高的靶標(biāo)IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8,以及炎癥因子IL-1β、IL-17水平。結(jié)果表明,模型組大鼠腎組織中IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、IL-1β、IL-17水平表達(dá)顯著增高,而芪黃藥對可以明顯降低大鼠腎組織中VEGFA、MAPK8、IL-1β、IL-6、IL-17的水平。研究表明,VEGF通路參與了腎間質(zhì)纖維化的病理改變過程,其相關(guān)機(jī)制是調(diào)節(jié)血管新生、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖等。VEGFA可促進(jìn)周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,使細(xì)胞外基質(zhì)持續(xù)累積,進(jìn)而加重腎纖維化[30]。MAPK通路的活化可激活下游TGF-β1基因的過度轉(zhuǎn)錄和翻譯,加劇ECM的沉積和炎癥反應(yīng)[31]。IL-1β、IL-6、IL-17與糖尿病腎病腎損害進(jìn)展有關(guān)[32-33],其表達(dá)水平與糖尿病動物模型及糖尿患者的蛋白尿程度呈正相關(guān),并可促進(jìn)糖尿病腎病的腎間質(zhì)纖維化[34]。表明芪黃藥對可能通過VEGF通路及MAPK通路改善糖尿病腎病炎癥反應(yīng)、清除炎癥因子而達(dá)到改善腎間質(zhì)纖維化的作用。

    綜上,芪黃藥對作用機(jī)制軸可能是“多成分-靶點(diǎn)(VEGFA、MAPK)-表型(炎癥反應(yīng))-功能(腎間質(zhì)纖維化)”。芪黃藥對具有保護(hù)腎功能、改善腎間質(zhì)纖維化、清除炎癥因子的作用。

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