基于HPLC指紋圖譜與多成分定量結(jié)合化學模式識別法評價不同產(chǎn)地白芍的質(zhì)量*

張生杰，田志梅，曹雪芹，龐文娟，王 麗

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

白芍是我國著名的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)和斂陰止汗的功效，自古以來既可作觀賞花卉又可作藥用，目前全國藥用白芍主產(chǎn)區(qū)為安徽亳州、浙江磐安、四川中江和山東菏澤[1]。中藥材作為特殊的農(nóng)產(chǎn)品，具有嚴格的道地性和對生態(tài)環(huán)境的選擇性，盲目進行引種，不僅違背了生態(tài)適應性和道地性原理，而且很難保證中藥材的適宜生長和增產(chǎn)保質(zhì)[2]。中藥材的質(zhì)量受環(huán)境影響較大，同一種植物在不同環(huán)境下會產(chǎn)生不同的性狀，中藥材的主要有效成分基本是次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物的生態(tài)作用就是抵御外界不良的生態(tài)脅迫，在逆境條件下才大量合成次生代謝產(chǎn)物，藥材質(zhì)量的形成是通過增加次生代謝形成的[3]?，F(xiàn)今杭白芍主產(chǎn)于浙江磐安縣和縉云縣等地區(qū)，該地區(qū)地處亞熱帶季風氣候，而甘肅走廊的氣候?qū)俅箨懶愿珊禋夂?，氣候干燥、冷熱變化劇烈，風大沙多，因此在不同地域種植的白芍其質(zhì)量定會存在差異，甘肅地區(qū)低溫、高海拔、低降水量將影響白芍藥材藥效物質(zhì)基礎。為保證用藥安全性、有效性，系統(tǒng)評價引種白芍與道地產(chǎn)區(qū)白芍的質(zhì)量差異是非常必要的。

中藥質(zhì)量控制與評價是中藥現(xiàn)代化研究的關鍵問題之一，目前化學成分檢測是絕大多數(shù)中藥質(zhì)量控制的主要手段，但很多成分缺乏專屬性、也沒有生物活性，這必將大大降低中藥質(zhì)量標準的實際價值，而且也很難真實反映中藥的質(zhì)量[4]。2016年，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標志物（Q-markers）的創(chuàng)新概念，為規(guī)范中藥質(zhì)量的研究和標準的建立奠定了基礎，有利于中藥全程質(zhì)量控制和質(zhì)量溯源體系的建立[5]。同時化學計量學的發(fā)展為中藥質(zhì)量研究提供了新的手段，化學模式識別是利用現(xiàn)代化分析技術分析中藥復雜化學數(shù)據(jù)，再用化學計量學方法對數(shù)據(jù)進行特征提取和處理分析[6-7]。本研究收集了白芍四大主產(chǎn)區(qū)和甘肅地區(qū)引種白芍，通過建立指紋圖譜，確認指標成分并同時測定其含量，利用化學模式識別分析不同產(chǎn)地白芍質(zhì)量，為全面評價白芍質(zhì)量提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試藥共收集了50批白芍樣品，其中包括來自安徽亳州、浙江磐安、四川中江和山東菏澤四大主產(chǎn)地40批，10批甘肅地區(qū)引種白芍樣品，均經(jīng)武威市藥品檢驗檢測中心中藥鑒定師張生杰鑒定為白芍飲片。

1.2 試劑沒食子酸對照品（批號：110831-201906，含量以91.5%計）、兒茶素對照品（批號：110877-201604，含量以99.2%計）、芍藥苷內(nèi)酯對照品（批號：190027-201902，含量以98.0%計）、芍藥苷對照品（批號：110736-201943，含量以95.1%計）（中國食品藥品檢定研究院）；1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟菍φ掌罚ㄅ枺?30031-201909，含量以98.0%計）、苯甲酰芍藥苷對照品（批號：02003-201902，含量以98.0%計）（北京更新生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，默克Merck公司，批號：10945730812）；其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器LC-20AD高效液相色譜配有DAD檢測器（日本島津公司）；MS105DU十萬分之一電子分析天平（梅特勒托利多）；UA10MFD超聲波清洗器（德國wiggens）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～10.0 min，95%～90%B；10.0～20.0 min，90%～80%B；20.0～30.0 min，80%～70%B；30.0～35.0 min，70%B；35.0～37.0 min，70%～50%B；37.0～50.0 min，50%B；檢測波長：232 nm；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.2 對照品溶液的制備取沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷對照品適量，用甲醇配成含沒食子酸105.31 mg/L、兒茶素115.43 mg/L、芍藥苷內(nèi)酯403.12 mg/L、芍藥苷997.35 mg/L、1,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖303.54 mg/L、苯甲酰芍藥苷107.35 mg/L的混合對照品溶液，作為對照品儲備液備用。

2.3 供試品溶液的制備取白芍細粉約1.0 g，精密稱定，置150 mL三角瓶中，加入70%乙醇約50 mL，稱定，超聲（300 W，50 kHz）處理30 min，放冷，70%乙醇補足，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密量取“2.2”項下混合對照品儲備液，依次用甲醇溶液稀釋20、10、5、2倍與對照品儲備液組成一系列混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，以峰面積（y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程。（見表1）

表1 6個化合物峰面積與濃度線性關系

2.4.2 精密度試驗 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品（S41）約1.0 g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣5次，測定峰面積值。結(jié)果表明沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟恰⒈郊柞Ｉ炙庈辗迕娣e的RSD分別為0.69%、0.29%、0.70%、0.16%、0.36%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品（S41）約1.0 g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于2、4、8、10、12、24 h，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積。結(jié)果供試品溶液在24 h內(nèi)色譜峰面積無明顯變化，沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷的RSD分別為0.59%、0.26%、0.11%、0.25%、0.97%、0.27%，表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品（S41）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，測定各成分含量。結(jié)果沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷含量平均值分別為0.80、0.85、4.71、29.89、2.38、0.94 mg/g，RSD分別為1.47%、1.27%、1.02%、0.85%、0.74%、0.92%，表明該方法重復性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品（S41）9份，每份約0.50 g，精密稱定，分別精密加入約供試品中待測成分含量70%、100%、130%的對照品各3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜峰峰面積，計算沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷的平均加樣回收率分別為98.17%、99.21%、98.76%、99.08%、99.72%、99.29%，RSD分別為1.82%、1.39%、0.80%、0.40%、0.49%、1.24%。（見表2）

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=3）

2.5 指紋圖譜的建立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜的建立 中藥指紋圖譜是通過對各樣本色譜圖進行比較，以反映其所含化學成分的差異，可全面反映中藥復雜的化學成分及其相對比例[8]。取不同產(chǎn)地50批白芍粉末，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，采集50批白芍色譜圖，將HPLC采集到的50批不同樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1版本）》軟件，以S1為參照指紋圖譜，采用多點校正后進行全譜峰自動匹配，并疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，見圖1。從50批白芍樣品的指紋圖譜中，共標記出9個共有峰，見圖2。通過與對照品圖譜比對，確認6個色譜峰，分別是1.沒食子酸、2.兒茶素、3.芍藥苷內(nèi)酯、4.芍藥苷、7.1,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖、8.苯甲酰芍藥苷，其峰面積和占共有峰面積的98%，6個指標成分基本可以代表白芍共有化合物信息。計算共有峰與對照指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9個共有峰的相對保留時間RSD值小于0.5%，表明方法的重復性較好；相對峰面積RSD值的范圍為14.9%～39.4%，說明不同產(chǎn)地白芍飲片的化學成分含量存在差異。

圖1 50批白芍飲片色譜峰匹配圖

圖2 白芍飲片的共有模式圖譜

2.5.2 相似度評價 將50批白芍樣品指紋圖譜的數(shù)據(jù)文件，導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.1版本）》軟件，計算各樣品指紋圖譜與生成對照圖譜的相似度，結(jié)果見表3，50批樣品與生成對照圖譜的相似度均大于0.996，表明不同產(chǎn)地的白芍飲片質(zhì)量一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 50批白芍飲片相似度分析結(jié)果

2.6 多指標成分的測定取50批白芍樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下同時測定樣品中沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷峰面積，采用外標法計算各組分百分含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定平均結(jié)果（mg/g，n=3）

續(xù)表4：

2.7 化學模式識別分析

2.7.1 聚類分析 以不同產(chǎn)地白芍樣品6個指標成分含量為變量，Z標準化，得到50×6階原始數(shù)據(jù)矩陣，運用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對其進行聚類分析，以歐式平方距離為區(qū)間，采用組間連接法，對50批白芍樣品進行聚類分析，結(jié)果表明，當分類距離為10~15之間時，50批白芍樣品被分成3類，S1~S10安徽產(chǎn)白芍、S31~S40山東產(chǎn)白芍與S41~S50甘肅引種白芍為1類，S11~S20四川產(chǎn)白芍為1類，S21~S30浙江產(chǎn)白芍為1類，說明安徽、山東和甘肅引種白芍質(zhì)量較為相似，與四川白芍與浙江白芍質(zhì)量差異較大。當分類距離為5時，50批白芍樣品將按照5個不同產(chǎn)地S1~S10安徽、S11~S20四川、S21~S30浙江、S31~S40山東、S41~S50甘肅分成5類，說明不同產(chǎn)地白藥質(zhì)量存在差異，同一產(chǎn)地的白芍質(zhì)量保持穩(wěn)定。（見圖3）

圖3 50批白芍聚類分析樹狀圖

2.7.2 主成分分析（PCA）Principal components analysis（PCA）法是中藥質(zhì)量評價中最常用的方法之一，且較為成熟，通過建立PCA模型分析能夠發(fā)現(xiàn)不同批次之間藥物質(zhì)量存在的微小差異[9]。將50批次白芍6個指標成分含量導入SPSS軟件，以主成分因子特征值、方差貢獻率為選擇主成分的依據(jù)進行主成分分析，得到特征值和方差貢獻率，特征值大于1的主成分有2個，累積方差貢獻率76.8%，見表5。提取主成分進行主成分載荷矩陣分析，主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分貢獻大小和作用方向[10]，沒食子酸、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷對第一個主成分貢獻較大，兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯對第二個主成分貢獻較大，都與其呈正相關性。利用模式識別統(tǒng)計分析軟件SIMCA 14.1對50批白芍樣品6個成分含量進行PCA分析，以主成分矢量為坐標軸作圖（二維，稱為scores圖），得到50批白芍的PCA圖，見圖4，可以反映類別間的差異。由圖4可直觀地反映出，50批樣品分布在不同象限，各樣品之間的距離反映了樣品間的相似程度，距離越近相似性越近，50批次白芍飲片主要分成3類，山東、安徽、甘肅為1類，說明山東、安徽、甘肅產(chǎn)白芍質(zhì)量較為接近；浙江產(chǎn)白芍為1類，四川產(chǎn)白芍為1類，說明浙江和四川產(chǎn)白芍具明顯的地域特點，這與聚類分析結(jié)果相一致。

表5 特征值和方差貢獻率

圖4 50批次白芍的PCA圖

2.7.3 不同產(chǎn)地白芍的綜合評價 綜合得分可判別樣品質(zhì)量優(yōu)劣，綜合得分越高說明質(zhì)量越好[11]，用2個主成分對白芍進行質(zhì)量評價，將主成分得分系數(shù)（見表6）與標準化后的化合物變量相乘求和得到主成分得分F1、F2，F(xiàn)1=0.286X1+0.039X2+0.084X3+0.222X4+0.282X5+0.280X6；F2=-0.096X1+0.648X2+0.585X3+0.113X4-0.020X5-0.097X6，并計算綜合得分F（F=0.558 6F1+0.209 7F2），F(xiàn)1、F2分別為主成分一、主成分二得分，0.558 6、0.209 7分別為主成分一、主成分二方差貢獻率[12]，根據(jù)主成分綜合得分模型計算樣品綜合得分，并對樣品指標成分含量進行打分，以6個指標成分總量乘以0.1為含量得分，以樣品編號為橫坐標，得分為縱坐標繪制折線圖，見圖5，可以發(fā)現(xiàn)樣品含量與主成分綜合得分有明顯的相關性，經(jīng)統(tǒng)計分析相關性顯著（r=0.860，P＜0.01）。說明主成分綜合得分能夠真實地反映飲片質(zhì)量，從主成分綜合得分分析，浙江（S21～S30）和四川（S11～S20）產(chǎn)白芍質(zhì)量較安徽（S1～S10）、山東（S31～S40）、甘肅甘肅（S41～S50）產(chǎn)白芍質(zhì)量好，體現(xiàn)了白芍藥材的道地性。

表6 主成分矩陣

圖5 S1～S50主成分綜合得分及6種成分含量測定結(jié)果比較

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇為了保證白芍化學成分盡可能多地在一張色譜圖上體現(xiàn)出來，且指標成分具有較好的分離度以便用于定量分析，通過HPLC二極管陣列檢測器全波長掃描，綜合考慮選擇232 nm作最佳檢測波長；用白芍主要成分混合對照品溶液考察在不同洗脫體系下梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫6種混合對照品的分離度較好，基線穩(wěn)定，色譜峰理論塔板數(shù)高，同時也適用于供試品溶液。在文獻研究的基礎上[13-15]，比較了50%、70%、90%乙醇提取溶劑，結(jié)果表明70%乙醇提取時峰面積和最大；考察了超聲、回流不同提取方法，從全面、快捷、綠色環(huán)保等因素考慮選擇超聲（300 W，50 kHz）處理30 min制備供試品溶液。

3.2 指紋圖譜的建立與相似度評價本研究建立了不同產(chǎn)地白芍飲片的HPLC指紋圖譜，方法簡單、重復性好，色譜峰的相對保留時間RSD小于0.5%，主要特征峰的分離度均大于1.2，其他峰也達到了一定的分離，共標記出9個共有峰，通過與圖譜比對確認了6種指標成分的色譜峰，其峰面積占共有峰面積98%，基本能夠代表白芍化合物信息，不同產(chǎn)地的白芍指紋圖譜相似度較高，表明不同產(chǎn)地白芍飲片的化學組成一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定。目前色譜指紋圖譜相似度只能從整體上表達指紋圖的平均相似程度，難以分辨指紋圖譜間的細微差異，這些細微差異可能是質(zhì)量評價的關鍵[16]，所以本實驗通過不同方法計算的相似度均大于0.996很難通過相似度來區(qū)分不同產(chǎn)地白芍質(zhì)量，需要結(jié)合化學模式識別等方法從化學成分的角度控制其質(zhì)量。

3.3 化學模式識別分析聚類分析法可將不同產(chǎn)地、品質(zhì)較接近的藥材進行聚類，從而可直觀地表現(xiàn)藥材間的親緣關系，聚類分析包括成分含量的信息，還直觀地包含了批次和產(chǎn)地信息，并對它們進行歸類是一種很好的評價中藥飲片質(zhì)量的統(tǒng)計方法[17]。當類間距離在10～15之間時，安徽產(chǎn)白芍與山東產(chǎn)白芍、甘肅引種白芍因親緣關系較近先聚為一類，這與安徽、山東環(huán)境條件相似，居群多樣性分化相對較小，據(jù)調(diào)查甘肅引種白芍種苗均來自安徽，說明它們遺傳物質(zhì)相似有關；浙江與四川產(chǎn)白芍各聚為一類，這與浙江、四川獨特的生長環(huán)境有關；在類間距為5時，50批白芍按照不同的產(chǎn)地分為5類，說明聚類分析法能夠反映不同產(chǎn)地白芍之間的多樣性分化，不同生長環(huán)境對白芍的質(zhì)量具有一定的影響，也證明了中藥品質(zhì)是由植物遺傳和生態(tài)環(huán)境雙重因素決定的。主成分分析確定了2個主成分，累計方差貢獻率76.8%，其中沒食子酸、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷對第一個主成分貢獻較大，兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯對第二個主成分貢獻較大，應考慮將沒食子酸、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯含量作為評價白芍質(zhì)量重要指標。利用SIMCA軟件可將樣品主成分載荷值快速進行可視化處理，并直觀地將樣品分類，與聚類分析結(jié)果相一致。采用HPLC的指紋圖譜結(jié)合化學模式識別通過SPSS、SIMCA軟件，能夠快速地進行聚類分析，建立不同產(chǎn)白芍質(zhì)量控制模式。

3.4 不同產(chǎn)地白芍質(zhì)量評價利用主成分分析建立的模型，可利用樣品主成分綜合得分評價藥材質(zhì)量[18]。本研究所建立的主成分分析模型，主成分綜合得分與含量得分有顯著相關性（r=0.860，P＜0.01），能夠真實反映白芍飲片的化學信息特征。從主成分綜合得分來看，浙江、四川產(chǎn)白芍質(zhì)量明顯比其他3個地區(qū)產(chǎn)白芍質(zhì)量好，這可能與浙江、四川獨特的生態(tài)環(huán)境相關，也體現(xiàn)了白芍藥材的道地性，可對白芍資源跟蹤調(diào)查研究，探討有效成分與生境之間的關系，對提高白芍藥材質(zhì)量具有一定的實際意義。甘肅引種白芍質(zhì)量與安徽、山東產(chǎn)白芍質(zhì)量相似，本研究通過對甘肅引種白芍和四大主產(chǎn)區(qū)（安徽亳州、浙江磐安、四川中江、山東菏澤）白芍飲片6種指標成分的測定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地白芍芍藥苷含量差異最小，平均百分含量2.9%，高于《中華人民共和國藥典》標準規(guī)定的1.2%，符合《中華人民共和國藥典》將芍藥苷作為白芍含量控制標準[19]，但僅通過芍藥苷一個成分很難真實反映白芍的質(zhì)量，起不到白芍質(zhì)量控制的目的，按照Q-markers的概念，需要進一步考察其他相對含量低且具有生物活性的成分。本實驗確定的其他5個指標成分沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、1,2,3,4,6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷符合中藥質(zhì)量標志物（Q-markers）的特征。甘肅引種白芍6個指標成分含量均高于平均值且質(zhì)量穩(wěn)定，說明該地區(qū)適合引種白芍，多成分含量測定的方法可用于白芍質(zhì)量控制，較單一成分控制更加全面、準確。