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    隔藥餅灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔血清脂聯(lián)素與 血脂水平的影響

    2021-11-21 12:52方園黃河劉邁蘭劉紅華馮芳常小榮
    關(guān)鍵詞:脂聯(lián)素動(dòng)脈粥樣硬化甘油三酯

    方園 黃河 劉邁蘭 劉紅華 馮芳 常小榮

    〔摘要〕 目的 觀察隔藥餅灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔血清脂聯(lián)素及血脂含量的影響。方法 將40只雄性新西蘭兔隨機(jī)分為正常組、模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組,每組10只,模型組喂食高膽固醇飼料,阿托伐他汀組予高膽固醇飼料加阿托伐他汀喂養(yǎng),隔藥餅灸組喂食高膽固醇飼料同時(shí)予以隔藥餅灸,12周后取材。采用ELISA法測定各組兔血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及血清脂聯(lián)素(ADPN)含量;HE染色觀察兔主動(dòng)脈管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 干預(yù)后,與正常組比較,模型組TC、TG、LDL-C均明顯升高(P<0.01),ADPN水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,隔藥餅灸組、阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C均不同程度降低(P<0.05,P<0.01),隔藥餅灸組ADPN含量升高(P<0.05),阿托伐他汀組ADPN水平升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較,模型組主動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)明顯受損;與模型組比較,隔藥餅灸組、阿托伐他汀組主動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)明顯改善。結(jié)論 隔藥餅灸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制,可能與調(diào)節(jié)血清ADPN含量、降低血脂水平、改善動(dòng)脈管壁損傷情況以及防治動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成有關(guān)。

    〔關(guān)鍵詞〕 動(dòng)脈粥樣硬化;隔藥餅灸;脂聯(lián)素;總膽固醇;甘油三酯;低密度脂蛋白膽固醇

    〔中圖分類號(hào)〕R245.8? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.001

    Effect of Herbal Cake-separated Moxibustion on Serum Adiponectin and Blood

    Lipid Levels in Rabbits with Atherosclerosis

    FANG Yuan1, HUANG He1, LIU Mailan1, LIU Honghua1, FENG Fang2*, CHANG Xiaorong1*

    (1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410000, China;

    2. West Hospital of Chenzhou First Peoples Hospital, Chenzhou, Hunan 423000, China)

    〔Abstract〕 Objective To observe the effect of herbal cake-separated moxibustion on serum adiponectin and lipid content of atherosclerotic rabbits. Methods 40 male New Zealand rabbits were randomly divided into normal group, model group, herbal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group, with 10 rabbits in each group. The model group was fed with high-cholesterol diet, the atorvastatin group was fed with high-cholesterol diet plus atorvastatin, and the herbal cake-separated moxibustion group was fed with high-cholesterol diet and given herbal cake-separated moxibustion, and samples were taken after 12 weeks. The content of serum total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and serum adiponectin (ADPN) were measured by ELISA. HE staining was used to observe the morphology and structure of rabbit aortic wall. Results After intervention, TC, TG and LDL-C in the model group were significantly higher than those in the normal group (P<0.01), the serum ADPN level in the model group decreased significantly? (P<0.01). Compared with the model group, TC, TG and LDL-C in herbal cake-separated

    moxibustion group and atorvastatin group were all decreased to different degrees (P<0.01, P<0.05), the serum ADPN content in the herbal cake-separated moxibustion group increased (P<0.05), the serum ADPN level in atorvastatin group increased, but the difference was not statistically significant? (P>0.05). Compared with the normal group, the aortic wall structure of the model group was

    significantly damaged, and compared with the model group, the aortic endothelial structure of the herbal cake-separated moxibustion group and atorvastatin group was significantly improved. Conclusion The anti-atherosclerotic mechanism of herbal cake-separated

    moxibustion may be related to regulating the content of serum ADPN, reducing the level of blood lipid, improving the injury of arterial wall, and preventing and treating the formation of atherosclerotic plaque.

    〔Keywords〕 atherosclerotic; herbal cake-separated moxibustion; adiponectin; total cholesterol; triglyceride; low density lipoprotein cholesterol

    以動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)為誘因的心血管疾?。╟ardiovascular diseases, CVD)是造成人類死亡的常見原因,據(jù)《中國心血管健康與疾病報(bào)告2020概要》中分析,至2018年心血管疾病的患病人數(shù)已達(dá)3.30億[1]。AS是大中動(dòng)脈血管壁內(nèi)脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥疾病,脂質(zhì)代謝異常是AS發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵因素之一,不僅可促進(jìn)AS發(fā)展,還可加速斑塊形成[2-4]。因此,調(diào)控脂質(zhì)代謝是臨床防治AS的重要環(huán)節(jié)。血清脂聯(lián)素(adiponectin, ADPN)主要是由脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì),在體外作為一種激素可減少炎癥反應(yīng)[5],具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、促血管生成和胰島素增敏等有益代謝的特性[6]。因此,ADPN被認(rèn)為是心血管疾病、代謝綜合征和/或2型糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥和胰島素抵抗的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[7-11]。

    目前,公認(rèn)的抗AS基石他汀類藥物,在降低重要心血管事情風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí),也增加了引發(fā)不良事件的概率[12],因而限制了其在臨床的應(yīng)用。近年來,關(guān)于艾灸防治AS的研究備受關(guān)注[13-14],其療效和優(yōu)勢日趨凸顯。常小榮教授前期研究[15-16]已經(jīng)證實(shí),隔藥餅灸對(duì)AS療效肯定。本研究通過對(duì)AS兔施以隔藥餅灸之后,觀察兔血清中血脂、ADPN含量變化,探討隔藥餅灸抗AS的可能作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    純種新西蘭兔(雄性,3月齡,體質(zhì)量1.5~2.5 kg)40只,由湖南太平生物有限公司提供[清潔級(jí),許可證號(hào):SCXK(湘)2015-0004],飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,每只分籠圈養(yǎng)于動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)溫度(25±1) ℃,濕度50%~70%。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

    1.2? 藥物與試劑

    阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司,10 mg/片,批號(hào):200517,國藥準(zhǔn)字,H20093819);丙硫氧嘧啶(上海朝暉藥業(yè)有限公司,50 mg/片,批號(hào):200428,國藥準(zhǔn)字號(hào):H31021082);細(xì)艾炷(湖南高圣生物有限公司生產(chǎn),規(guī)格:5.3 mm×85 mm);總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司,批號(hào):20191219);脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Elabscience公司,批號(hào):R0619c);蘇木素-伊紅染液(武漢谷歌生物科技有限公司,產(chǎn)品編號(hào)G1005-500 mL);中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):10004160);磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司,批號(hào):SH30256.01B)。

    1.3? 主要儀器

    臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海佑科儀表有限公司,型號(hào):YP60001);GloMax酶標(biāo)儀(Promega公司,型號(hào):GM3030);移液槍(Eppendorf艾本德公司,10~1 000 μL);包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司,型號(hào):JB-P5);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,型號(hào):RM2016);組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司,型號(hào):KD-P);正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康,型號(hào):Nikon Eclipse CI);成像系統(tǒng)(日本尼康,型號(hào):Nikon DS-U3)。

    1.4? 分組與模型制備

    1.4.1? 動(dòng)物分組? 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,分為正常組、模型組、隔藥餅灸組(AS模型組+隔藥餅灸)、阿托伐他汀組(AS模型組+阿托伐他?。?,每組10只。

    1.4.2? 模型制備? 正常組喂食普通飼料;模型組、隔藥餅灸組、阿托伐他汀組喂食高膽固醇飼料,具體配方:膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油5%、正常粗顆粒飼料84%,丙硫氧嘧啶10 mg/(kg·d)。每只兔每日總食量約120 g,單籠飼養(yǎng),飲水不限,連續(xù)喂養(yǎng)12周。每組隨機(jī)抽3只兔檢測,采血并解剖取主動(dòng)脈,當(dāng)血脂水平提示顯著升高,解剖見主動(dòng)脈內(nèi)壁有粥樣斑塊凸出,表明模型制備成功[17]。

    1.5? 干預(yù)方式

    驗(yàn)證造模后,每組各7只兔,正常組喂食普通飼料,模型組喂食高膽固醇飼料。其他2組分別按被試因素予以隔藥餅灸和喂食阿托伐他?。ò⑼蟹ニ》踇1.96 mg/(kg·d)]拌入第1口飼料,食畢補(bǔ)充普通飼料),共4周。

    1.6? 選穴與定位

    1.6.1? 選穴? Ⅰ組:巨闕、天樞(雙)、豐隆(雙)共5穴;Ⅱ組:心俞(雙)、肝俞(雙)、脾俞(雙)共6穴。

    1.6.2? 取穴定位? 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[18]及擬人比照法制定。巨闕:胸劍聯(lián)合下2寸;天樞:恥骨聯(lián)合上緣上5寸,前正中線旁開2寸處;豐?。盒⊥鹊耐鈧?cè)面正中,膝關(guān)節(jié)至踝關(guān)節(jié)的中點(diǎn);心俞:以手指摸到枕項(xiàng)部的第一個(gè)椎體棘突為第2頸椎棘突起,依次數(shù)到第5胸椎棘突下旁開1.5 cm處;肝俞:第9胸椎棘突旁開1.5 cm處;脾俞:第11胸椎棘突旁開1.5 cm處。

    1.7? 施灸方法

    (1)藥餅的藥物組成:將丹參、山楂、郁金、大黃、澤瀉等比例粉碎為末。(2)藥餅制作:使用時(shí),將上述藥粉以醋現(xiàn)調(diào)成糊狀,捏壓成厚0.3 cm、直徑為1 cm的藥餅。(3)隔藥餅灸法:取穴定位后剪毛,將藥餅置于施灸穴位上,再將細(xì)支艾條剪成2 cm左右艾炷,置于藥餅上施灸,每穴連續(xù)灸4壯(約30 min),每日1次,Ⅰ、Ⅱ組穴位隔日交替施灸,連續(xù)4周。

    1.8? 觀察指標(biāo)與檢測方法

    各組按被試因素分別干預(yù)4周,第29天對(duì)各組兔禁食不禁水12 h。

    1.8.1? 血液采集與檢測? 將實(shí)驗(yàn)兔置于兔臺(tái)固定,于耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉(按體質(zhì)量4 mL/kg計(jì)量),麻醉成功后,剖腹,取腹主動(dòng)脈血4 mL,先將其放置于裝有10%的乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na)230 μL試管中,再放入裝有40 000 U/mL抑肽酶40 μL的試管中,將試管充分搖勻后,放入恒溫離心機(jī),4 ℃恒溫,離心10 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min,離心半徑13.5cm),完成后提取上清液放入-20 ℃的冰箱,采用ELISA法檢測血清中TC、TG、LDL-C及ADPN的含量。

    1.8.2? 組織收集與檢測? 采血后,充分暴露主動(dòng)脈,提取腹主動(dòng)脈分叉處至上端主動(dòng)脈血管,PBS沖洗,置于滅菌10 mL采血管內(nèi),以4%多聚甲醛固定,24 h后再行石蠟切片的制備,以備HE染色檢測。取主動(dòng)脈組織固定后,依次常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、二甲苯透明、切片,HE染色后顯微鏡下觀察其病理改變并收集圖片。

    1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以“x±s”表示,組間兩兩比較,若方差齊時(shí)選擇LSD法,方差不齊用Dunnett T3法分析。不滿足正態(tài)性時(shí)選擇秩和檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1? 各組兔血脂水平比較

    與正常組比較,模型組TC、TG、LDL-C水平均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,隔藥餅灸組、阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C水平均不同程度降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

    2.2? 各組兔主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

    正常組主動(dòng)脈管壁厚度均勻,內(nèi)膜光滑、完整、連續(xù),未見泡沫細(xì)胞與斑塊形成;模型組主動(dòng)脈管壁粗糙,厚度不均,受損嚴(yán)重,可見明顯斑塊和脂質(zhì)沉積,有大量泡沫細(xì)胞出現(xiàn),提示AS模型成功。干預(yù)后,隔藥餅灸組內(nèi)膜稍增厚、層次清晰、連續(xù)性較好,平滑肌細(xì)胞厚度均勻、排列整齊,見極少泡沫細(xì)胞;阿托伐他汀組管壁較平整,內(nèi)膜輕微增厚,平滑肌細(xì)胞排列整齊,少量脂質(zhì)浸及,見少量泡沫細(xì)胞。見圖1。

    2.3? 各組兔血清ADPN含量比較

    與正常組比較,模型組血清ADPN含量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,隔藥餅灸組血清ADPN含量明顯升高(P<0.05),阿托伐他汀組血清ADPN含量呈上升趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    3 討論

    隔藥餅灸是集艾灸、經(jīng)絡(luò)腧穴與中藥為一體的綜合療法,是針灸療法的重要組成部分。AS在中醫(yī)學(xué)里可與“胸痹”“中風(fēng)”“眩暈”“脈痹”等疾病對(duì)應(yīng),其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),即以臟腑功能失調(diào)為本,尤以心、肝、脾三臟最為密切,以痰濁、血瘀等病理產(chǎn)物為標(biāo)。AS病程大多較長,“久病入絡(luò)、絡(luò)病治血”,故認(rèn)為本病宜從治血入手選用大黃、山楂、澤瀉、郁金、丹參作為藥餅的成分。現(xiàn)代研究[19]表明,大黃可通過抗脂質(zhì)過氧化而防治AS;山楂、澤瀉、郁金均具有降脂、抗AS作用[20-21];《本草綱目》中記載丹參“能破宿血,補(bǔ)新血”,現(xiàn)代研究[22-23]發(fā)現(xiàn)丹參可降低血清中TC、LDL-C含量,有抗AS、改善微循環(huán)等作用。本研究選取兩組穴位,心俞、巨闕分別為心之俞募穴、俞募配穴,可改善心功能,使心氣充沛、心血充盈、脈道通利、血行通暢;肝俞、脾俞,針對(duì)AS肝失疏泄、脾失健運(yùn)所致的痰瘀互結(jié)證候,以疏肝健脾、化痰散瘀,促進(jìn)脂質(zhì)代謝;天樞為大腸募穴,可疏通腸道,調(diào)節(jié)水谷精微在腸道的吸收和排泄;豐隆為胃之絡(luò)穴,可健脾祛濕化痰,防無形之痰,散有形之痰,使脈道通利。兩組穴位共奏疏肝健脾、調(diào)理后天之功,達(dá)到調(diào)節(jié)血脂和抗AS的目的。

    AS的發(fā)生與脂質(zhì)代謝障礙、血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)[24-25]。血管內(nèi)皮損傷是AS發(fā)生發(fā)展的使動(dòng)環(huán)節(jié),高脂血癥是引起血管內(nèi)皮損傷的主要因素之一,而AS的發(fā)生與TG、TC、LDL-C水平明顯相關(guān)[26],因此,維持脂質(zhì)代謝平衡,積極控制血脂水平,對(duì)防治AS具有重要臨床意義。脂聯(lián)素,又稱Acrp30(脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)30 kDa蛋白),是脂肪組織分泌的一種特異性脂肪因子[27]。脂聯(lián)素水平受體脂分布影響[28],且與體脂含量呈負(fù)相關(guān)。低脂聯(lián)素血癥可直接促進(jìn)心血管系統(tǒng)的病理反應(yīng),成為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,低水平的脂聯(lián)素可增加AS的風(fēng)險(xiǎn)[29]。

    脂聯(lián)素與脂蛋白代謝的各種參數(shù)相關(guān),尤其與高密度脂蛋白(HDL)和TG的代謝相關(guān)。脂聯(lián)素可誘導(dǎo)血清HDL升高,并通過增強(qiáng)富含TG的脂蛋白的分解代謝降低血清TG[30]。血清TG水平升高是內(nèi)皮功能障礙的獨(dú)立預(yù)測因子,脂聯(lián)素降低循環(huán)TG水平可能改善內(nèi)皮功能[31]。王雪梅等[32]研究發(fā)現(xiàn),外源性補(bǔ)充血清脂聯(lián)素可降低血清TC、TG和LDL-C,從而使異常血脂趨于正常。隨著脂聯(lián)素水平的升高,AS模型小鼠體質(zhì)量明顯下降。臨床研究[33]發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、TC/LDL-C比值呈正相關(guān)。楊奕櫻等[34]研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥小鼠血清脂聯(lián)素水平與低密度脂蛋白受體(LDLR)、LDL-C呈負(fù)相關(guān)。在AS病變中,脂聯(lián)素可在脂紋中聚集形成細(xì)胞,抑制血管細(xì)胞粘附因子-1、清道夫受體A和腫瘤壞死因子α的表達(dá)[35]。有研究[36]發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞泡沫化,使膽固醇含量明顯下降,發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組TC、TG、

    LDL-C均明顯升高(P<0.01),血清中ADPN含量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,隔藥餅灸組、阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C降低(P<0.05,P<0.01),血清ADPN含量不同程度升高,且隔藥餅灸組升高明顯(P<0.05),表明兩種治療均可降低AS兔血脂水平、促進(jìn)AS兔血清ADPN的表達(dá),但隔藥餅灸療效較阿托伐他汀更好。

    綜上所述,隔藥餅灸可降低AS兔血脂(TC、TG、LDL-C)水平,明顯升高血清脂聯(lián)素含量,改善動(dòng)脈管壁的損傷情況,防治AS斑塊的形成而發(fā)揮抗AS效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性:首先,樣本量比較少;其次,檢測技術(shù)和設(shè)備有限,并不能精準(zhǔn)說明隔藥餅灸與阿托伐他汀在治療AS方面的差異。因此,需要大樣本量的研究及運(yùn)用更精確的檢測技術(shù),以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度。

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