依達(dá)拉奉對急性缺血性卒中患者外周血自噬及氧化應(yīng)激水平的影響*

李雪莉，楊清武

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400038)

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)是臨床常見的腦血管疾病之一，目前，該疾病呈現(xiàn)“四高”特征，主要表現(xiàn)為發(fā)病率、病死率、致殘率及復(fù)發(fā)率高，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。AIS患者腦梗死區(qū)及梗死周圍區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡及壞死是引起患者神經(jīng)功能障礙的直接原因，同時繼發(fā)的機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥通路的激活可進(jìn)一步加重神經(jīng)功能障礙[2]。盡管積極的溶栓和介入取栓在AIS的臨床治療中發(fā)揮了重要作用，但有效的藥物治療也不可替代。依達(dá)拉奉是一種腦保護(hù)劑，可明顯抑制脂質(zhì)過氧化，防止神經(jīng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，已廣泛用于腦梗死引起的神經(jīng)病變[3]。近年來，細(xì)胞自噬與AIS發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系逐漸被人們所認(rèn)識。有研究表明，在AIS動物模型中機(jī)體細(xì)胞自噬明顯激活，抑制過度激活的細(xì)胞自噬可明顯改善AIS動物模型神經(jīng)功能，同時降低其病死率[4]。而依達(dá)拉奉是否可降低AIS患者自噬水平，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究探討了依達(dá)拉奉對AIS患者外周血細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激及炎癥水平的影響，旨在為其臨床運用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年12月本院收治的AIS患者150例作為研究對象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對照組，每組75例。兩組患者性別、年齡、病程、基礎(chǔ)疾病及基礎(chǔ)治療方案等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)并征得了患者書面知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)滿足AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)行靜脈溶栓或動脈取栓治療。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)合并腦出血；(2)嚴(yán)重意識障礙；(3)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病及嚴(yán)重感染；(4)入院24 h內(nèi)死亡；(5)對藥物(依達(dá)拉奉)過敏。

1.4 治療方法

對照組入院后根據(jù)AIS診治指南[5]給予相應(yīng)基礎(chǔ)治療，發(fā)病3～6 d內(nèi)者予以溶栓或取栓規(guī)范化治療，同時給予抗血小板、調(diào)脂、降壓、腦保護(hù)等處理。觀察組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上入院當(dāng)天即給予依達(dá)拉奉(國藥集團(tuán)國瑞藥業(yè)有限公司，批號20160822，規(guī)格20 mL：30 mg)30 mg配以 100 mL生理鹽水注射液靜脈滴注，每天2次。兩組患者均連續(xù)治療2周。兩組患者調(diào)脂藥物均采用阿托伐他汀(美國輝瑞公司)20 mg，每天1次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1自噬相關(guān)基因mRNA水平

收集兩組患者治療前及治療2周后外周血標(biāo)本各2 mL，提取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，采用TRIzol提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物序列見表2。建立20 μL反應(yīng)體系，包括1 μL cDNA、2 μL×PCR緩沖液、2.0 mmol MgCl2、0.2 mmol dNTP、每種引物1.0 μL及0.5 μL Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火45 s；溶解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s。以GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計算靶基因相對mRNA水平。

1.5.2外周血炎性和氧化應(yīng)激指標(biāo)

分別于治療前及治療2周后采集兩組患者外周血3 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定外周血炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]和氧化應(yīng)激指標(biāo)[丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)]。具體操作依據(jù)試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)說明書進(jìn)行。

1.5.3神經(jīng)功能

分別于治療前及治療2周后采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(national institute of health stroke scale，NIHSS)評分和日常生活活動能力(activities of daily living，ADL)量表評估兩組患者神經(jīng)功能。NIHSS評分越低表示神經(jīng)功能越好，ADL評分越高表示神經(jīng)功能越好。

表2 PCR引物序列

1.5.4腦血流動力學(xué)

分別于治療前及治療2周后采用經(jīng)顱超聲多普勒測定兩組患者大腦動脈血流情況，包括基底動脈、左右側(cè)大腦中動脈血流等。

1.5.5不良反應(yīng)

記錄兩組患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況，包括出血、惡心、嘔吐、皮疹等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者治療前后自噬相關(guān)基因mRNA水平比較

兩組患者治療前PBMC中自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療2周后上述指標(biāo)均較治療前降低，且觀察組患者低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.2 兩組患者治療前后外周血炎性和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

兩組患者治療前外周血氧化應(yīng)激(MDA、SOD)和炎性指標(biāo)(IL-1β、TNF-α)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療2周后MDA、IL-1β、TNF-α均較治療前降低，且觀察組患者低于對照組(P<0.05)；SOD均較治療前升高，且觀察組患者高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.3 兩組患者治療前后神經(jīng)功能比較

兩組患者治療前神經(jīng)功能(NIHSS、ADL評分)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療2周后NIHSS評分均較治療前降低，ADL評分均較治療前升高，且觀察組NIHSS評分低于對照組，ADL評分高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表3 兩組患者治療前后自噬相關(guān)基因mRNA水平比較

表4 兩組患者治療前后外周血炎性和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 兩組患者治療前后腦血流動力學(xué)比較

兩組患者治療前腦血流動力學(xué)指標(biāo)基底動脈、左右側(cè)大腦中動脈血流比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者治療2周上述指標(biāo)均較治療前升高，且觀察組患者高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

2.5 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較

觀察組患者中治療期間發(fā)生出血1例，惡心、嘔吐1例，皮疹1例，不良反應(yīng)發(fā)生率為4.0%；對照組患者中治療期間發(fā)生出血1例，惡心、嘔吐1例，不良反應(yīng)發(fā)生率為2.7%。兩組患者不良反應(yīng)均較輕微，未經(jīng)特殊處理癥狀均自行消失。兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表5 兩組患者治療前后神經(jīng)功能比較分)

表6 兩組患者治療前后腦血流動力學(xué)指標(biāo)比較

3 討 論

AIS是腦血管疾病中的危重癥，隨著我國進(jìn)入人口老年化，該病發(fā)病率及病死率均呈逐年升高趨勢。近年來廣泛開展的卒中三級預(yù)防，對降低AIS發(fā)病率及病死率發(fā)揮了重要作用，在三級預(yù)防的基礎(chǔ)上如何進(jìn)一步提高AIS患者的療效和改善其預(yù)后是目前臨床醫(yī)師關(guān)注的重點。AIS的發(fā)生機(jī)制主要與多種原因如動脈粥樣硬化、心源性血栓及小動脈閉塞等引起腦組織血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致組織缺血、缺氧有關(guān)[6]。目前，針對AIS患者已成立卒中中心，采取多種方法進(jìn)行救治，如第一時間溶栓或取栓恢復(fù)腦組織缺血再灌注；積極運用抗血小板、調(diào)脂、神經(jīng)保護(hù)等藥物，挽救受損神經(jīng)細(xì)胞等。

近年來，相關(guān)研究表明，細(xì)胞自噬在多種疾病如動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、惡性腫瘤等的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[7-9]。細(xì)胞自噬是機(jī)體通過吞噬及降解受損細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器，維持機(jī)體細(xì)胞代謝穩(wěn)定的過程。但一旦機(jī)體遭受某些刺激如缺血、缺氧、酸中毒等，可顯著激活機(jī)體細(xì)胞自噬[10]。目前，有研究表明，細(xì)胞自噬在AIS發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起著雙重作用，一方面AIS發(fā)生可促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞自噬的過度激活，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死，并增加腦梗死面積和加重神經(jīng)功能的缺損；另一方面若在腦組織缺血缺氧前激活細(xì)胞自噬可顯著降低神經(jīng)元死亡和腦損傷程度[11-12]。因此，自噬在AIS發(fā)生、發(fā)展中的作用可能取決于其激活的時間差異(AIS發(fā)生前或后)及程度。

依達(dá)拉奉作為神經(jīng)保護(hù)劑，通過有效清除氧自由基，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，但對細(xì)胞自噬通路的影響目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果顯示，針對AIS患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用依達(dá)拉奉可明顯降低機(jī)體過度激活的細(xì)胞自噬。有研究表明，過度的細(xì)胞自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而激活氧化應(yīng)激及炎性通路，加重組織器官損傷及細(xì)胞功能障礙[13]。對AIS患者，依達(dá)拉奉可明顯降低機(jī)體氧化應(yīng)激和炎性相關(guān)指標(biāo)水平，其可能與依達(dá)拉奉降低機(jī)體過度激活的細(xì)胞自噬有關(guān)。

NIHSS、ADL評分是評價AIS患者臨床療效及預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)，NIHSS評分越高表示神經(jīng)功能越差，ADL評分越高表示神經(jīng)功能越佳。本研究結(jié)果顯示，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上依達(dá)拉奉可明顯降低NIHSS評分，升高ADL評分，更有效地恢復(fù)AIS患者受損的神經(jīng)功能，與其他研究結(jié)果一致[14]。除NIHSS、ADL評分外，腦血流動力學(xué)也是一項評估AIS患者臨床療效的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉可明顯改善AIS患者腦血流，可能與降低細(xì)胞自噬、改善氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，從而降低血液黏度、抑制血小板黏附與聚集、同時改善血管內(nèi)皮功能有關(guān)。針對AIS患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用依達(dá)拉奉并未明顯增加不良反應(yīng)發(fā)生率，說明在提高AIS患者療效及預(yù)后的同時安全性較好，值得臨床進(jìn)一步推廣運用。

綜上所述，依達(dá)拉奉可明顯降低AIS患者機(jī)體過度激活的細(xì)胞自噬及下游氧化應(yīng)激和炎性通路的激活，從而減輕腦組織缺血再灌注損傷，有助于恢復(fù)受損的神經(jīng)功能。但目前依達(dá)拉奉如何降低細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步通過動物及細(xì)胞實驗予以研究。