miR-365a-3p靶向調(diào)控JAK-STAT信號通路抑制三陰性乳腺癌細胞的惡性生物行為研究

黃君華，王 瓊，楊 進，但家強，黃元坤，譚旭東△

(四川省成都市第五人民醫(yī)院：1.甲狀腺乳腺外科；2.健康管理中心 611130)

乳腺癌是起源于女性乳腺上皮細胞的惡性腫瘤，2018年全球腫瘤普查性研究表明，乳腺癌占女性惡性腫瘤新確診病例的 25%，已成為全球范圍內(nèi)影響女性身體健康最常見的惡性腫瘤[1-2]。而三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)作為侵襲性最高的乳腺癌類型[3]，占乳腺癌確診病例的15%～25%[4]，早期即可出現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。且由于無法應用曲妥珠單抗等生物靶向藥物，臨床治療手段較為局限，故多數(shù)TNBC患者出現(xiàn)病灶侵襲及轉(zhuǎn)移預后差，極易復發(fā)，生存時間短[5]。因此，探究TNBC生物治療靶標及潛在的發(fā)生、發(fā)展機制對開發(fā)TNBC的臨床治療方式、改善患者預后具有重要意義。

微小RNA(micro RNA，miRNA)是內(nèi)生性非編碼短鏈核苷酸序列，可調(diào)控體內(nèi)1/3的蛋白編碼基因[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過調(diào)節(jié)下游信號通路參與調(diào)控TNBC腫瘤細胞的侵襲、發(fā)展，并與TNBC耐藥性及預后相關(guān)[7-8]。XU等[7]報道,miRNA-193通過靶向作用磷脂酰肌醇-3-羥激酶及蛋白激酶B等通路促進TNBC的進展，而UMEH-GARCIA等[8]則發(fā)現(xiàn)，miR-127可通過下調(diào)神經(jīng)酰胺激酶活性進而抑制TNBC侵襲、轉(zhuǎn)移。最近有研究表明，miR-365a-3p通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B/β-鏈蛋白等相關(guān)通路參與了結(jié)直腸癌、喉癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]，然而miR-365a-3p在TNBC組織中表達如何、是否介導TNBC的惡性生物行為及潛在的作用機制尚不可知，故本研究針對TNBC，探究了miR-365a-3p的作用及潛在機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2019年12月本院收治的行外科手術(shù)切除治療的TNBC患者50例，年齡35～67歲，平均(51.78±9.84)歲。納入標準：(1)經(jīng)病理學及影像學檢查確診為TNBC；(2)術(shù)前未接受任何形式的非外科治療。排除標準：乳腺癌復發(fā)或合并其他惡性腫瘤者。本研究符合本院倫理委員會制訂的相關(guān)標準。

1.2 方法

1.2.1細胞及試劑

人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC-1937、MCF-7均購自武漢大學生命科學系，其中MDA-MB-468為TNBC細胞株。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、Lipofectamine 2000均購自廣州派真生物科技公司。miR-365a-3p 模擬物(mimic) 及陰性對照(Negative control，NC)mimic均購自上海吉凱生物科技有限公司。CCK-8試劑購自上海碧云天生物科技公司。細胞質(zhì)雙面蛋白酪氨酸激酶(janus Kinase,JAK)和信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)及β-actin抗體均購自美國Abcam生物公司。

1.2.2標本及臨床資料收集

所有患者均取1份腫瘤組織，并取癌灶邊緣3 cm的癌旁組織作為對照。提取組織后迅速放置-80 ℃進行保存并進行相關(guān)后續(xù)實驗，同時收集患者年齡、腫瘤大小、Ki67表達水平、浸潤范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床資料。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)

將MCF-10A、MDA-MB-468、MDA-MB-231、HCC-1937、MCF-7培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)并置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞生長融合度為70%～80%時用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化傳代。按照Lipofectamine 2000試劑說明書將TNBC細胞株MDA-MB-468轉(zhuǎn)染miR-365a-3p mimic和NC mimic探究miR-365a-3p對TNBC細胞株的惡性生物行為。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測miR-365a-3p表達水平

采用Trizol裂解TNBC組織及TNBC細胞系并用總 RNA 純化試劑盒提取乳腺癌細胞總RNA；用QuantiTect Reverse Transcription Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用兩步擴增法進行PCR擴增。隨后進行熒光定量檢測。miR-365a-3p、U6及內(nèi)參 GAPDH的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平。

1.2.5蛋白提取及Western blot實驗

用RIPA裂解乳腺癌細胞提取細胞總蛋白后采用蛋白質(zhì)定量(BCA)法測定蛋白濃度。然后將蛋白在80 V電壓下進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后在120 V條件下采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別孵育JAK、STAT、β-actin抗體，并4 ℃過夜。漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。采用電化學發(fā)光(ECL)發(fā)光液檢測蛋白條帶，并用Image J進行條帶定量計算。

表1 miR-365a-3p、U6及GAPDH的引物序列

1.2.6CCK-8實驗檢測MDA-MB-468增殖能力

將5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。然后每孔加入10 μL CCK-8試劑后在培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1 h。在轉(zhuǎn)染miR-365a-3p mimic和NC mimic后第0、24、48、72、96 h檢測波長450 nm處的光密度值。

1.2.7克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力

MDA-MB-468細胞轉(zhuǎn)染24 h后以0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸并接種至6孔板，每孔800個細胞。置37 ℃、5% CO2及飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周后采用4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色，低倍顯微鏡下拍照記錄細胞克隆數(shù)。

1.2.8Transwell法檢測細胞侵襲能力

將轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-468細胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后加入Transwell上室無血清培養(yǎng)，Transwell下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細胞于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用棉簽擦去Transwell上室細胞。4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色。隨機選取5個視野計數(shù)每個視野中的遷移或侵襲細胞數(shù)。

1.2.9細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取6×105個轉(zhuǎn)染后的細胞并將其接種于6孔板，在6孔板背面畫5條平行線作為標記，24 h后槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，用磷酸鹽緩沖溶液洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。置于放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行孵育。

1.2.10雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烆A測miR-365a-3p的潛在靶通路

通過TargetScan在線預測 JAK 是否存在與 miR-365a-3p的可匹配的堿基序列。將JAK基因3′-端非編碼區(qū) (3′-untranslated region，3′-UTR)構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體上，將JAK-野生型(wild type,WT)和JAK-突變型(mutant type,MUT) 分別與NC mimic及miR-365a-3p mimic轉(zhuǎn)染 至MDA-MB-468細胞內(nèi)。孵育72 h 后檢測細胞中熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-365a-3p在TNBC組織及TNBC細胞系中的表達水平

與癌旁組織比較，TNBC組織中miR-365a-3p表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A。同時腫瘤越大、Ki67表達水平越高、浸潤范圍越深、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越差患者miR-365a-3p表達水平越低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。此外與正常乳腺上皮細胞MCF-10A比較，乳腺癌細胞中miR-365a-3p表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B。

表2 TNBC患者臨床特征與miR-365a-3p表達水平比較

A：TNBC組織和癌旁組織中miR-365a-3p表達水平；B：乳腺癌細胞及正常乳腺上皮細胞中miR-365a-3p表達水平。

2.2 miR-365a-3p促進TNBC細胞的惡性生物行為

轉(zhuǎn)染miR-365a-3p mimics后miR-365a-3p表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2A，提示轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染miR-365a-3p mimics后MDA-MB-468細胞增殖水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2B。與NC mimics組比較，miR-365a-3p mimics組細胞克隆集落形成能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2C。轉(zhuǎn)染miR-365a-3p mimics后TNBC細胞遷移能力受損，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2D。高表達miR-365a-3p可抑制MDA-MB-468細胞侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2E。

2.3 miR-365a-3p靶向調(diào)控JAK-STAT的通路

JAK啟動子區(qū)存在miR-365a-3p的靶向結(jié)合位點，即JAK可能是miR-365a-3p靶向調(diào)節(jié)基因，見圖3A。JAK-WT+miR-365a-3p共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性明顯降低，與JAK-MUT+miR-365a-3p共轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3 B。miR-365a-3p mimics組JAK、STAT蛋白水平較NC mimics組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3C。

A：轉(zhuǎn)染miR-365a-3p模擬物后miR-365a-3p 表達水平；B：miR-365a-3p促進細胞增殖；C：miR-365a-3p提高細胞擊落形成能力；D:miR-365a-3p促進細胞遷移能力 (200×)； E:miR-365a-3p促進乳腺癌細胞侵襲能力(200×)。

A：JAK 是miR-365a-3p潛在靶點；B：miR-365a-3p-WT降低熒光活性；C：miR-365a-3p模擬物可降低JAK、STAT蛋白表達水平。

3 討 論

TNBC是具有高度侵襲性、轉(zhuǎn)移性和異質(zhì)性的乳腺癌亞型，該亞型患者發(fā)病年齡低，早期即出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時對常規(guī)內(nèi)分泌和靶向藥物治療無效，預后差，復發(fā)率高，嚴重威脅著人類健康[7]。因此，探究TNBC發(fā)生、發(fā)展機制對完善臨床治療方式、改善患者預后極為重要。miRNA可通過調(diào)控編碼蛋白的表達而控制腫瘤細胞生長、分化、侵襲等病理過程，成為近年來乳腺癌研究的熱點問題，也是實現(xiàn)TNBC精準基因靶向治療的重要研究方向[12]。

miR-365a-3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的抗癌因子，其異常表達參與了眾多實體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與多種疾病的不良預后有關(guān)。HONG等[9]報道，低表達miR-365a-3p結(jié)腸癌患者無復發(fā)生存率和總生存率明顯降低，同時是結(jié)腸癌患者預后的獨立危險因素。而LI等[10]則通過功能學實驗發(fā)現(xiàn)，miR-365a-3p作為長鏈非編碼RNAZEB1-AS1的下游調(diào)控基因可明顯抑制肝癌細胞增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，TNBC組織中miR-365a-3p明顯降低，同時低表達miR-365a-3p患者腫瘤范圍更大、Ki67表達水平較高、浸潤深、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期較差提示低表達miR-365a-3p作為抗癌因子與TNBC的不良預后明顯相關(guān)。因此，本研究進一步通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，各乳腺癌細胞系miR-365a-3p均較低，與臨床組織學結(jié)果一致。通過轉(zhuǎn)染miR-365a-3p mimics發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-468細胞內(nèi)miR-365a-3p表達升高，同時能明顯抑制MDA-MB-468細胞株增殖、集落形成、遷移及侵襲能力，表明高表達miR-365a-3p可明顯阻滯TNBC細胞株發(fā)生、發(fā)展，抑制其惡性生物學行為，提示miR-365a-3p可作為TNBC潛在的治療靶點。

盡管現(xiàn)有研究表明，E2F轉(zhuǎn)錄因子2、核轉(zhuǎn)錄因子-κB及跨膜蛋白Robo1等作為miR-365a-3p靶通路參與了眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-13]，然而miR-365a-3p調(diào)控TNBC的增殖和侵襲等惡性生物行為的作用機制尚不明確，本研究通過 TargetScan軟件發(fā)現(xiàn)，JAK編碼基因存在與miR-365a-3p序列存在可匹配位點，繼而通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，miR-365a-3p靶向調(diào)控JAK蛋白基因。而STAT作為JAK的下游蛋白，二者共同組成JAK-STAT順序通路信號參與腫瘤的進展。本研究結(jié)果顯示，miR-365a-3p可明顯抑制JAK-STAT蛋白表達水平，提示miR-365a-3p通過靶向抑制JAK-STAT信號通路。而最新有研究表明，JAK-STAT信號通路突變激活后可促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲[14]，同時通過誘導原細胞源性因子的表達參與了乳腺癌的耐藥性[15]，進一步佐證了JAK-STAT信號通路可作為miR-365a-3p的調(diào)控靶點抑制TNBC細胞的惡性生物行為。

綜上所述，miR-365a-3p在TNBC腫瘤樣本和乳腺癌細胞系中表達水平下降，同時與TNBC患者的不良預后指標存在相關(guān)性，此外miR-365a-3p可通過抑制JAK-STAT信號通路而抑制TNBC細胞株的惡性生物行為，為解釋TNBC發(fā)展的潛在機制及開發(fā)新的治療靶點提供了重要參考。