不同貯藏年限沙蔥種子萌發(fā)及呼吸生理的變化

楊忠仁，郭 霏，張 東，宋曉青，宋煜靜，秦 怡，張鳳蘭，郝麗珍

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

種子萌發(fā)是植物開始生長的先決條件，也是長期保存植物種質(zhì)資源的重要前提。然而，即使在最佳條件下長期儲存，種子活力也不可避免地會持續(xù)下降，直至死亡。因此，種子老化是一個累積的和不可逆轉(zhuǎn)的生物氧化過程，可導(dǎo)致幼苗出苗延遲或不出苗，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)資源更新均有嚴(yán)重影響[1-2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，膜完整性喪失[3-4]、酶降解[5]、呼吸減弱[6]和遺傳物質(zhì)降解[7-8]等是種子發(fā)生老化的主要生理表現(xiàn)。其中，呼吸強(qiáng)度是反映種子代謝活動水平的重要指標(biāo)。種子在保存過程中呼吸逐漸減弱，發(fā)芽率隨之降低[6]，且在發(fā)芽力喪失之前，種子表現(xiàn)出復(fù)雜的呼吸模式[9]。研究發(fā)現(xiàn)，種子經(jīng)老化處理后，與呼吸作用有關(guān)的線粒體標(biāo)志酶細(xì)胞色素C氧化酶和蘋果酸脫氫酶活性降低[6]，線粒體電子傳遞鏈的還原性提高，線粒體的呼吸控制比降低，氧化磷酸化進(jìn)程受到抑制[10]，使三磷酸腺苷(ATP)合成底物供應(yīng)不足，導(dǎo)致種子活力開始下降，并最終喪失萌發(fā)的能力。

沙蔥(AlliummongolicumRegel.) 又名蒙古韭、胡穆利(蒙語)[11]，屬百合科(Liliaceae)蔥屬(AlliumLiliaceae.)多年生草本植物[12]。有研究指出，其種子使用壽命長達(dá)2～4年[13]，按種子壽命長短將其分為中等壽命類種子，這與以往“蔥屬植物為短命種子”[14]的定論有分歧。沙蔥種子與其他蔥屬植物種子的差異受到眾多研究者的重視。楊忠仁等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥種子采收適宜時間為花后35～40 d，在種子萌發(fā)過程中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸之間相互轉(zhuǎn)化。王曉娟等[17]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥種皮障礙是造成種子休眠的原因之一。常海文等[18]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥種子在貯藏陳化過程中萌發(fā)能力與抗氧化酶活性呈顯著正相關(guān)。但有關(guān)沙蔥種子呼吸代謝相關(guān)酶的研究報道極少。沙蔥是兼具蔬菜和飼草功用的蒙古高原特有種，其營養(yǎng)價值遠(yuǎn)超國際一級苜蓿[19]，草原羊采食沙蔥后其肉品質(zhì)和風(fēng)味明顯改善[20]，然而，野生沙蔥因氣候變化和放牧過度等因素破壞嚴(yán)重，亟待通過人工栽培馴化來合理地開發(fā)和利用，而了解其種子特性是進(jìn)行人工馴化栽培的首要工作。為此，本試驗以貯藏不同年限的沙蔥種子為材料，測定其萌發(fā)指標(biāo)、種子呼吸速率及呼吸關(guān)鍵酶活性，探討貯藏過程中各指標(biāo)的變化機(jī)制，以期為沙蔥種質(zhì)資源保存提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

貯藏1～10年的沙蔥(AlliummongolicumRegel.)種子，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 萌發(fā)指標(biāo)測定 取貯藏1～10年的沙蔥種子，用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉(NaClO)溶液殺菌消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后放在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(d=9 cm)中進(jìn)行萌發(fā)試驗，恒溫培養(yǎng)箱溫度為(20±1) ℃，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。以胚根突破種皮為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每隔24 h記錄1次并補(bǔ)水，第10天結(jié)束試驗，統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽勢，測定鮮質(zhì)量(發(fā)芽或吸脹狀態(tài)時的質(zhì)量)以及胚根長，計算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[21]。

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢=(第3天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt；

式中：Gt為t時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時間(d)。

活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽指數(shù)×鮮質(zhì)量。

1.2.2 生理指標(biāo)測定 取貯藏1～10年的沙蔥種子，用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉(NaClO)溶液殺菌消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后于室溫下吸脹6 h后進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。參考Benamar等[10]的方法，采用Chlorolab 2型液相氧電極(Hansatech公司)測定種子的耗氧速率，即呼吸速率。采用植物細(xì)胞色素C氧化酶試劑盒(美國RD公司)測定酶活性。參考劉淵等[22]的方法測定酸性磷酸酶活性。采用植物異檸檬酸脫氫酶試劑盒(美國RD公司)測定異檸檬酸脫氫酶活性。參考鄧秋菊等[23]的方法測定蘋果酸脫氫酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，用Origin 8.0 軟件制圖，以Duncan’s新復(fù)極差法比較處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏時間沙蔥種子萌發(fā)指標(biāo)的變化

種子萌發(fā)指標(biāo)是衡量種子質(zhì)量最基本的指標(biāo)，可體現(xiàn)種子在某一時期的生活力和活力。由表1 可知，隨貯藏時間的延長，沙蔥種子萌發(fā)指標(biāo)值整體表現(xiàn)出先上升后下降趨勢，其中貯藏1～3年種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈升高趨勢，貯藏3年后種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢達(dá)最高，顯著高于貯藏4～10年種子；發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在貯藏1～2年內(nèi)呈升高趨勢，貯藏2年后達(dá)最高，之后整體呈逐漸下降趨勢。

2.2 不同貯藏時間沙蔥種子呼吸速率的變化

不同貯藏時間沙蔥種子呼吸速率的變化見圖1。由圖1可知，沙蔥種子呼吸速率隨著貯藏時間的延長整體呈降低趨勢，貯藏1～8年種子呼吸速率基本穩(wěn)定在0.10 mg/(g·h)，其中貯藏3年種子呼吸速率顯著高于其他年限種子。而貯藏9～10年沙蔥種子的呼吸速率顯著低于其他年限種子。

2.3 不同貯藏時間沙蔥種子細(xì)胞色素C氧化酶活性的變化

細(xì)胞色素C氧化酶是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈上的終端酶，直接與ATP合成有關(guān)。由圖2可知，沙蔥種子細(xì)胞色素C氧化酶活性隨著貯藏時間延長呈先上升后下降趨勢，且貯藏3年時最高，之后逐漸降低，以貯藏10年時最低。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示處理間存在顯著差異(P<0.05)。下圖同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).The same below圖1 不同貯藏時間沙蔥種子呼吸速率的變化Fig.1 Changes of respiration rate of A.mongolia seeds at different storage times

圖2 不同貯藏時間沙蔥種子細(xì)胞色素C氧化酶活性的變化Fig.2 Changes of cytochrome C oxidase of A.mongolia seeds at different storage times

2.4 不同貯藏時間沙蔥種子酸性磷酸酶活性的變化

酸性磷酸酶是一類存在于生物體內(nèi)水解有機(jī)磷酸脂鍵的酶，在種子萌發(fā)過程中通過催化磷酸酯鍵的水解，促使其將貯存的ATP釋放出來，供種子萌發(fā)所用。由圖3所知，不同貯藏年限沙蔥種子的酸性磷酸酶活性隨著貯藏時間延長呈先升高后降低的變化趨勢，且貯藏3年沙蔥種子的酶活性顯著高于其他年限種子，酶活性增幅也最大；貯藏10年沙蔥種子酶活性最低，且顯著低于其他年限種子。

2.5 不同貯藏時間沙蔥種子異檸檬酸脫氫酶活性的變化

異檸檬酸脫氫酶是檸檬酸循環(huán)(TCA)中重要的限速酶，其活性變化對整個TCA循環(huán)的活躍程度有很大影響。由圖4可知，沙蔥種子異檸檬酸脫氫酶活性隨著貯藏時間延長呈持續(xù)降低趨勢。其中貯藏1年沙蔥種子異檸檬酸脫氫酶活性最大，貯藏2～4年沙蔥種子降幅不大，但貯藏5年后酶活性開始大幅下降。

圖4 不同貯藏時間沙蔥種子異檸檬酸脫氫酶活性的變化Fig.4 Changes of isocitrate dehydrogenase activity of A.mongolia seeds at different storage times

2.6 不同貯藏時間沙蔥種子蘋果酸脫氫酶活性的變化

蘋果酸脫氫酶是TCA途徑的關(guān)鍵酶，可以反映TCA循環(huán)的活化程度及種子的呼吸代謝強(qiáng)度。由圖5所知，沙蔥種子蘋果酸脫氫酶活性隨著貯藏時間延長呈先升高后降低的趨勢，至貯藏10年時達(dá)到最低。其中貯藏5年沙蔥種子的酶活性顯著高于其他年限種子，之后大幅下降。

3 討 論

3.1 不同貯藏時間沙蔥種子活力的變化

老化是貯藏過程中影響種子質(zhì)量和活力的主要因素，因此在種子貯藏過程中，保持較高水平的種子質(zhì)量和活力至關(guān)重要。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都是反映種子生活力和活力的重要指標(biāo)，也是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)[24]。隨著長時間的貯藏，種子逐漸老化，表現(xiàn)為種子發(fā)芽率逐漸降低[18,25]，萌發(fā)幼苗生長受到抑制[26]。本試驗結(jié)果顯示，貯藏1～3年沙蔥種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈升高趨勢，3年內(nèi)種子發(fā)芽率差異不顯著，貯藏4～10年種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢整體顯著降低；發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)在貯藏1～2年內(nèi)呈顯著升高趨勢，在貯藏3～10年呈降低趨勢，表明沙蔥種子在自然環(huán)境和自身生理生化指標(biāo)變化等因素的共同作用下，老化程度加深，種子活力逐漸減小。這與田茜等[27]的研究結(jié)果一致。

3.2 不同貯藏時間沙蔥種子呼吸生理的變化

呼吸作用是一切生活細(xì)胞所共有的生命活動，是植物新陳代謝的一個重要組成部分。在種子萌發(fā)初期，種子呼吸速率與線粒體發(fā)育、貯藏物質(zhì)、生理代謝以及呼吸酶系活性等有密切關(guān)系[28]。種子老化過程中線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性降低，ATP合成減少[29]。本試驗結(jié)果顯示，種子呼吸速率和細(xì)胞色素C氧化酶活性整體變化趨勢一致，在貯藏3年時最高，推測細(xì)胞色素C氧化酶活性降低造成了線粒體呼吸速率的下降。

酸性磷酸酶在生物體內(nèi)催化水解有機(jī)磷酸酯鍵，釋放出植物可以吸收利用的磷酸根離子(Pi)，而Pi是TCA循環(huán)中合成ATP的底物，因此酸性磷酸酶活性強(qiáng)弱間接影響TCA循環(huán)的快慢。施農(nóng)農(nóng)等[30]認(rèn)為，酸性磷酸酶活性高低是反映水稻種子發(fā)芽力強(qiáng)弱的關(guān)鍵指標(biāo)，與種子萌發(fā)后貯藏物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。異檸檬酸脫氫酶在TCA循環(huán)中擔(dān)任限速酶的角色[31]。蘋果酸脫氫酶活性可以在較大程度上反映TCA循環(huán)的活化程度，催化蘋果酸和草酰乙酸的相互轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，蘋果酸脫氫酶與種子萌發(fā)、細(xì)胞生長、花粉發(fā)育、糖的積累、果實發(fā)育和成熟、植物抗逆等關(guān)系密切[32-33]。本試驗結(jié)果顯示，沙蔥種子酸性磷酸酶活性隨著貯藏時間延長呈先升高后降低的變化趨勢。異檸檬酸脫氫酶活性隨著貯藏時間延長呈降低趨勢，貯藏5年時酶活性急劇下降；而蘋果酸脫氫酶活性隨著貯藏時間延長呈先升高后降低趨勢，貯藏5年時最高,顯著高于其他年限。推測可能是由于貯藏5年后種子酸性磷酸酶和異檸檬酸脫氫酶活性降低，TCA循環(huán)中蘋果酸脫氫酶活性和Pi合成受到抑制，TCA循環(huán)底物供應(yīng)不足，影響了種子的正常呼吸生理。因此，在實際生產(chǎn)中，建議選擇貯藏3年內(nèi)的沙蔥種子。