傳染性脾腎壞死病毒、鱖魚蛙病毒和鱖彈狀病毒三重PCR檢測方法的建立

梁紅茹，馬賽亞，付小哲，林 強，劉禮輝，牛銀杰，黃志斌，林 蠡，李寧求

(1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380;2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院,廣東 廣州 570228)

水產(chǎn)品中的名優(yōu)魚類如鱖、鱸、鱧等，由于肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、蛋白含量高等優(yōu)點越來越受歡迎。目前名優(yōu)魚類養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，已成為我國一種重要的淡水養(yǎng)殖魚類。然而，近年來我國鱖魚、鱸魚等主養(yǎng)區(qū)常發(fā)生暴發(fā)性死亡，研究發(fā)現(xiàn)主要是由3種病毒引起，分別是傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鱖魚蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus，SCRIV)及鱖彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)。ISKNV是吳淑勤等[1]在病鱖體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并證明了該病毒正是鱖魚大規(guī)模暴發(fā)傳染病的主要病原之一；而后何建國等[2]進一步對該病毒進行深入探究，將其命名為傳染性脾腎壞死病毒；SCRIV屬虹彩病毒科，近年來感染鱖魚較為普遍，具有較高的致病率和致死率[3-5]；SCRV具有極強的致病性，感染后的臨床癥狀通常表現(xiàn)為內(nèi)臟、皮膚和魚鰭出血，死亡率高達90%[6]。這3種病毒是近些年引起鱖魚發(fā)病的主要病毒病原體，一旦發(fā)病，就會導(dǎo)致極高的死亡率，且三者的臨床癥狀經(jīng)常難以區(qū)分且經(jīng)?；旌细腥荆壳吧形窗l(fā)現(xiàn)有效的治療措施，嚴重威脅著鱖魚養(yǎng)殖業(yè)的健康和產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。

雖然3種病毒常混合感染，但目前檢測方法僅能針對單一病毒或2種病毒，費時費力；急需開發(fā)能同時檢測3種病毒的鑒別診斷方法。為此，本試驗嘗試通過三重PCR檢測方法，建立操作簡單、靈敏度高、特異性強，且可同時檢測ISKNV、SCRIV和SCRV 3種病原的方法，以期為鱖魚等養(yǎng)殖品種流行病學(xué)調(diào)查提供方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病 原 傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)、鱖魚蛙病毒(SCRIV)、鱖彈狀病毒(SCRV)、傳染性胰壞死病毒(IPNV)、草魚呼腸孤病毒(GCRV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、神經(jīng)壞死病毒(NNV)、羅非魚湖病毒(TiLV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)，均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所保存。

1.1.2 試劑與儀器 PCR儀(晶格，中國)，核酸電泳儀(北京六一，中國)，凝膠成像系統(tǒng) VerSa Doc2000(Bio-Rad，美國)，微量分光光度計(南京五義，中國)。

1.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中ISKNVMCP基因序列(HQ317460.1)、SCRIVMCP基因(MG941005.1)和SCRVN基因的(NC008514.1)，針對ISKNVMCP基因及其保守區(qū)分別設(shè)計引物為：ISKNV-MCP-F/ISKNV-MCP-R和ISKNV-550-F/ISKNV-550-R；針對SCRIVMCP基因及其保守區(qū)分別設(shè)計引物為：SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R和SCRIV-400-F/SCRIV-400-R；針對SCRV的N基因及其保守區(qū)分別設(shè)計引物為：SCRV-N-F/SCRV-N-R和SCRV-780-F/SCRV-780-R。各引物均由廣州艾基生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 本研究所用的引物信息Table 1 Information of primers used in this study

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別以感染ISKNV、SCRIV、SCRV的臨床樣品為模板，以其對應(yīng)引物ISKNV-MCP-F/ISKNV-MCP-R、SCRIV-MCP-F/SCRIV-MCP-R、SCRV-N-F/SCRV-N-R分別進行PCR 擴增。PCR反應(yīng)總體系為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，對應(yīng)引物分別各1 μL，模板1 μL，用ddH2O補充至25 μL。同時以ddH2O代替模板作陰性對照。PCR 擴增反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產(chǎn)物純化后，取4 μL PCR產(chǎn)物與1 μL pEASY-T1載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，同時將質(zhì)粒送廣州艾基生物科技有限公司進行測序鑒定，構(gòu)建重組質(zhì)粒P-ISKNV、P-SCRIV、P-SCRV。

1.4 三重PCR檢測方法的建立

分別進行單一PCR擴增和三重PCR擴增來驗證引物的特異性，PCR反應(yīng)總體系為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R或SCRIV-400-F/SCRIV-400-R或SCRV-780-F/SCRV-780-R，或ISKNV-550-F/ISK-NV-550-R+SCRIV-400-F/SCRIV-400-R+SCRV-780-F/SCRV-780-R各1 μL，模板P-ISKNV、P-SCRIV、P-SCRV或P-ISKNV+P-SCRIV+P-SCRV 1 μL，用ddH2O補充至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸 7 min，同時用ddH2O代替模板作陰性對照，對所得擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 三重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

為使3個片段均得到有效擴增，設(shè)定56～65 ℃ 10個退火溫度，每個處理相差1 ℃，以及27種不同的引物用量，同時設(shè)立以ddH2O代替模板的處理為陰性對照，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。確定最佳退火溫度后進行引物用量的優(yōu)化，(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)引物用量均設(shè)0.5，1，1.5 μL共3個劑量，分別交叉組合后共27個處理。同時設(shè)立以ddH2O代替模板作陰性對照，所得PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.6 三重PCR檢測方法的敏感性和特異性檢測

1.6.1 敏感性檢測 取10 ng/μL的3種質(zhì)粒P-ISKNV、P-SCRIV和P-SCRV各1 μL，用ddH2O混勻后進行10倍梯度稀釋。稀釋后取10-1～10-8倍稀釋的3種陽性模板，利用優(yōu)化后的最佳PCR體系和條件進行擴增，同時用ddH2O代替模板作陰性對照，以確定三重PCR檢測方法反應(yīng)的敏感性。

1.6.2 特異性檢測 分別取 IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV的核酸產(chǎn)物1 μL作為模板，以ISKNV、SCRIV、SCRV、ISKNV+SCRIV+SCRV混合模板為陽性對照，用ddH2O代替模板作為陰性對照，在最佳條件下進行PCR擴增，驗證此法的特異性。

1.7 三重PCR檢測方法的應(yīng)用

對中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所2019年采集并保存的22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的樣品(編號為1～22)，分別進行單一PCR檢測和三重PCR檢測，設(shè)立以標準質(zhì)粒P-ISKNV、P-SCRIV和P-SCRV代替模板的陽性對照組，用ddH2O代替模板作為陰性對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISKNV、SCRIV和SCRV重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將ISKNV、SCRIV和SCRV對應(yīng)的模板和引物進行PCR擴增，擴增片段大小分別約1 300,1 392和1 290 bp(圖1)，將這些片段分別與T1載體連接，經(jīng)PCR及測序鑒定，證實片段與預(yù)期相符，證明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒P-ISKNV、P-SCRIV、P-SCRV。陰性對照均未擴增出條帶。

M.DNA Marker DL2000；1.目標基因擴增產(chǎn)物；2.陰性對照組M.DNA Marker DL2000；1.Amplification products of target gene；2.Negative control

2.2 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法的建立

ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR 引物特異性試驗結(jié)果見圖2。

M.DNA Marker DL2000;1.ISKNV MCP基因保守區(qū)單一PCR擴增；2.SCRIV MCP單一PCR擴增基因保守區(qū)；3.SCRV N基因保守區(qū)單一PCR擴增；4.擴增MCP、MCP和N基因保守區(qū)的三重PCR；5.陰性對照M.DNA Marker DL2000；1.Single PCR amplification conserved region of ISKNV MCP gene；2.Single PCR amplification conserved region of SCRIV MCP gene；3.Single PCR amplification conserved region of SCRV N gene；4.Multiplex PCR amplification conserved region of MCP,MCP and N gene；5.Negative control

通過單一PCR，能擴出ISKNVMCP基因保守區(qū)約550 bp的片段、SCRIVMCP基因保守區(qū)約400 bp的片段和SCRVN基因保守區(qū)約780 bp的片段；通過三重PCR，能同時擴出上述3個基因保守區(qū)；陰性對照組無擴增條帶(圖2)。

2.3 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳退火溫度 在確定最佳退火溫度試驗的10個擴增結(jié)果中，可觀察到56～65 ℃各梯度處理均可擴增出目的條帶(圖3)，其中60 ℃下目的條帶最亮，該溫度下N基因和MCP基因的保守區(qū)擴增條帶最清晰且特異，因此將60 ℃定為最佳退火溫度。

2.3.2 最佳引物濃度 由圖4可以看出，在27個引物處理中，當(dāng)(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SC-RV-780-R)為1/1.5/0.5 μL擴增條帶(16號條帶)最亮，因此1/1.5/0.5 μL為最佳引物用量。

綜合以上2個試驗結(jié)果，可得優(yōu)化后的三重PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)體系組成為：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物ISKNV-550-F/ISKNV-550-R 1 μL、SCRIV-400-F/SCRIV-400-R 1.5 μL、SCRV-780-F/SCRV-780-R 0.5 μL，模板P-ISKNV、P-SCRIV和 P-SCRV各1 μL，用ddH2O補充至25 μL；擴增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

M.DNA Marker DL2000；1～10.分別為退火溫度56～65 ℃的PCR產(chǎn)物,每處理相差1 ℃；11.陰性對照M.DNA Marker DL2000；1-10.PCR products at annealing temperatures from 56-65 ℃,the difference between each treatment is 1 ℃；11.Negative control圖3 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法退火溫度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of annealing temperature for ISKNV,SCRIV and SCRV multiplex PCR detection

M.DNA Marker DL2000；1～23,25～28.(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)引物用量分別為0.5/0.5/0.5，0.5/0.5/1，0.5/0.5/1.5，0.5/1/0.5，0.5/1/1，0.5/1/1.5，0.5/1.5/0.5，0.5/1.5/1，0.5/1.5/1.5，1/0.5/0.5，1/0.5/1，1/0.5/1.5，1/1/0.5，1/1/1，1/1/1.5，1/1.5/0.5，1/1.5/1，1/1.5/1.5，1.5/0.5/0.5，1.5/0.5/1，1.5/0.5/1.5，1.5/1/0.5，1.5/1/1，1.5/1/1.5，1.5/1.5/0.5，1.5/1.5/1，1.5/1.5/1.5 μL；24，29.陰性對照M.DNA Marker DL2000；1-23,25-28.Ratio of primer dosage to (ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R) was 0.5/0.5/0.5，0.5/0.5/1，0.5/0.5/1.5，0.5/1/0.5，0.5/1/1，0.5/1/1.5，0.5/1.5/0.5，0.5/1.5/1，0.5/1.5/1.5，1/0.5/0.5，1/0.5/1，1/0.5/1.5，1/1/0.5，1/1/1，1/1/1.5，1/1.5/0.5，1/1.5/1，1/1.5/1.5，1.5/0.5/0.5，1.5/0.5/1，1.5/0.5/1.5，1.5/1/0.5，1.5/1/1，1.5/1/1.5，1.5/1.5/0.5，1.5/1.5/1，1.5/1.5/1.5 μL，respectively；24，29.Negative control圖4 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法引物用量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of primer proportion for ISKNV,SCRIV and SCRV multiplex PCR detection

2.4 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法的敏感性

ISKNV、SCRIV和SCRV質(zhì)粒分別10倍系列稀釋，取10-1～10-8倍稀釋的模板進行三重PCR擴增。結(jié)果(圖5)顯示，稀釋倍數(shù)為10-3時仍能擴增出3條明顯的目的條帶，說明該方法對ISKNV、SCRIV和SCRV DNA的檢測下限均為0.01 ng/μL。

M.DNA Marker DL2000；1～8.分別為10-1～10-8倍稀釋的ISKNV、SCRIV、SCRV擴增產(chǎn)物；9.陰性對照M. DNA Marker DL2000；1-8.10-1-10-8 times dilution of ISKNV，SCRIV and SCRV；9.Negative control圖5 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法的敏感性試驗Fig.5 Sensitivity test of ISKNV,SCRIV and SCRV multiplex PCR detection

2.5 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法的特異性

在最佳條件下進行PCR擴增，檢測此方法的特異性，結(jié)果(圖6)顯示， 以IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、ISKNV、TiLV、SVCV核酸產(chǎn)物為模板均未擴出目的條帶，以ISKMV、SCRIV、SCRV和ISKNV+SCRIV+SCRV混合模板分別成功擴增出目的條帶。

M.DNA Marker DL2000；1.IPNV；2.GCRV；3.KHV；4.SGIV；5.NNV；6.ISKNV；7.TiLV；8.SVCV；9.ISKNV；10.SCRIV；11.SCRV；12.陰性對照；13.以ISKNV+SCRIV+SCRV為模板的陽性對照M.DNA Marker DL2000；1.IPNV；2.GCRV；3.KHV；4.SGIV；5.NNV；6.ISKNV；7.TiLV；8.SVCV；9.ISKNV；10.SCRIV；11.SCRV；12.Negative control；13.Positive control with ISKNV+SCRIV+SCRV template圖6 ISKNV、SCRIV和SCRV三重PCR檢測方法的特異性Fig.6 Specificity of ISKNV,SCRIV and SCRV multiplex PCR detection

2.6 ISKNV、SCRIV和SCRV臨床樣品的檢測

圖7～10表明，單一PCR檢測與三重PCR檢測的結(jié)果基本一致；在22份感染樣品中，ISKNV陽性6份，陽性率為27%；SCRIV陽性9份，陽性率為41%；SCRV陽性樣品有2份，陽性率為9%；其中ISKNV和SCRIV均為陽性的樣品有2份，陽性率為9%；SCRIV和SCRV均為陽性的樣品有2份，陽性率為9%；ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染陽性率為0。

M.DNA Marker DL2000；1～22.分別對應(yīng) 1～22號臨床樣品；23.陽性對照；24.陰性對照；下同M.DNA Marker DL2000；1-22.Corresponding to 1-22 clinical samples respectively；23.Positive control；24.Negative control;The same below圖7 ISKNV、SCRIV和SCRV疑似臨床樣品的單一ISKNV PCR檢測Fig.7 ISKNV single PCR test of ISKNV,SCRIV and SCRV suspected clinical samples

圖8 ISKNV、SCRIV和SCRV疑似臨床樣品的單一SCRIV PCR檢測Fig.8 SCRIV single PCR test of ISKNV,SCRIV and SCRV suspected clinical samples

圖9 ISKNV、SCRIV和SCRV疑似臨床樣品的單一SCRV PCR檢測Fig.9 SCRV single PCR test of ISKNV,SCRIV and SCRV suspected clinical samples

圖10 ISKNV、SCRIV和SCRV疑似臨床樣品的三重PCR檢測Fig.10 Multiplex PCR test of ISKNV,SCRIV and SCRV suspected clinical samples

3 討 論

鱖魚養(yǎng)殖歷史悠久，是我國優(yōu)質(zhì)淡水魚之一，其以產(chǎn)量高、肉嫩、刺少、味甜、蛋白質(zhì)豐富等營養(yǎng)價值而被消費者喜愛。然而隨著我國鱖魚養(yǎng)殖技術(shù)、設(shè)備和飼料市場的迅速擴張和發(fā)展[7]，傳染性脾腎壞死病毒、鱖魚蛙病毒和鱖彈狀病毒等病毒病已成為制約鱖魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素[8-10]。這3種病毒具有毒力強、致死率高等特點，且鱖魚常發(fā)生多種病毒的混合感染。因此在沒有特效治療藥物的情況下，對病原的快速診斷具有更加重要的意義[11-13]。

本試驗建立的三重PCR檢測方法是在同一反應(yīng)體系中加入3對引物，同時擴增出3條目的條帶的技術(shù)，多重PCR成功建立的關(guān)鍵是引物設(shè)計以及反應(yīng)條件的優(yōu)化[14-16]。本次試驗根據(jù)目前已報道的ISKNVMCP基因、SCRIVMCP基因和SCRVN基因序列信息中的保守區(qū)域[17-18]，在綜合考慮每對引物的特異性和引物之間可能發(fā)生的反應(yīng)前提下，設(shè)計了3對引物，其中SCRVN基因最初擴增條帶為280 bp，但其在試驗過程中易因污染而造成假陽性，條件優(yōu)化后ISKNV、SCRIV、SCRV三者擴增片段分別為550，400和780 bp，片段大小差異較明顯，能在瓊脂糖凝膠電泳中明顯區(qū)分且無其他非特異性條帶。

多重PCR擴增效率會受到擴增溫度和各引物之間用量比例的影響，在反應(yīng)條件的優(yōu)化過程中，27組引物用量、10個連續(xù)退火溫度處理中50%以上能得到3條清晰的目的條帶，最終確定60 ℃為最佳退火溫度，(ISKNV-550-F/ISKNV-550-R)/(SCRIV-400-F/SCRIV-400-R)/(SCRV-780-F/SCRV-780-R)3種引物最佳用量為1/1.5/0.5 μL。優(yōu)化后的三重PCR反應(yīng)體系可以特異性擴增不同病毒的特異性片段，且無非特異性擴增，說明此檢測方法對不同病毒都能進行準確檢測。

應(yīng)用建立的三重PCR方法對22份疑似混合感染樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，ISKNV、SCRIV和SCRV陽性樣品分別有6份，9份和2份，ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染陽性率為0份，與單一PCR檢測的結(jié)果吻合率高達100%，表明本研究所建立的三重PCR檢測方法可適用于臨床樣品的檢測和病原學(xué)調(diào)查。

目前尚無ISKNV、SCRIV和SCRV特效治療藥物，本研究建立的三重PCR方法可快速、特異性檢測ISKNV、SCRIV和SCRV 3種感染鱖魚的常見病毒，靈敏度高，且可一次性對以上3種病毒進行鑒定，提高了臨床診斷的效率，可為流行病學(xué)調(diào)查提供便利。