Ce3+、VC和Ac-DEVD-CHO浸種對(duì)沙蔥種子抗氧化系統(tǒng)的影響

王佳琪，李 娜，魏鵬超，楊忠仁，3，張 東，張鳳蘭，3

種子是種子植物的生殖器官，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基礎(chǔ)的生產(chǎn)材料。種子在成熟后，會(huì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸老化直至失去活力，這一過(guò)程是不可逆的。種子老化主要表現(xiàn)為質(zhì)膜完整性降低、保護(hù)酶系統(tǒng)活性下降、有毒物質(zhì)積累[1]。沙蔥（Allium mongolicum Regel.）為百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium L.）多年生草本植物[2]，具有獨(dú)特的辛辣味，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，被譽(yù)為“菜中靈芝”，可炒食、焯水后涼拌、烹調(diào)拌餡，亦可腌漬或干制。沙蔥種子萌發(fā)后可作為芽菜開(kāi)發(fā)利用[3]，種子還可作調(diào)味佐料，沙蔥籽油是一種很好的保健油[4]。在沙蔥種子貯藏過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其易發(fā)生老化劣變，種子壽命縮短，嚴(yán)重影響了沙蔥的開(kāi)發(fā)利用和種質(zhì)資源的保存。因此，探究緩解沙蔥種子老化和提高種子活力的方法對(duì)于減少種質(zhì)資源浪費(fèi)的研究具有重大意義。

我國(guó)稀土資源豐富，是世界稀土儲(chǔ)存量最多的國(guó)家，我國(guó)開(kāi)始“稀土農(nóng)用”研究始于20 世紀(jì)70年代初。有研究證明，適宜濃度的稀土元素能夠提高植物種子活力和抗氧化酶活性[5-6]、降低活性氧和MDA含量[7]，會(huì)對(duì)植物體內(nèi)Ca2+水平起替代作用[8]，并會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收[9]、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[10]、光合作用和抗逆性產(chǎn)生影響[11-12]。在稀土中，元素豐度排在第一的為Ce[13]。抗壞血酸（VC）是一種重要的小分子活性物質(zhì)，主要參與生命體內(nèi)的物質(zhì)代謝和氧化還原反應(yīng)[14]，有降低活性氧（ROS）、提高抗氧化酶活性和降低MDA 含量的作用[15]。半胱氨酸酶家族是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，半胱氨酸-3 酶（caspase-3 酶）的活化會(huì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞程序性死亡。GE 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，用Ac-DEVD-CHO 處理東北紅豆杉細(xì)胞能夠抑制caspase-3 酶活性，從而達(dá)到降低細(xì)胞凋亡率的目的，因此提出·O2-激活caspase-3 酶導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的研究結(jié)論。

為了研究Ce3+、VC 和Ac-DEVD-CHO 對(duì)沙蔥種子抗氧化酶活性的影響及對(duì)其有害物質(zhì)的抑制作用，本試驗(yàn)選用CeCl3、VC 和Ac-DEVD-CHO 3 種物質(zhì)對(duì)不同貯藏年限自然老化的沙蔥種子進(jìn)行浸種處理，并對(duì)處理后沙蔥種子的抗氧化酶活性和有害物質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為緩解沙蔥種子老化及有效保存其種質(zhì)資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以采自毛烏素沙地且貯藏3年、5年和7年的沙蔥種子為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)處理

沙蔥種子經(jīng)2% NaClO 消毒10 min，用蒸餾水沖洗4 次后進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)的影響因素為不同的浸種溶液，以蒸餾水浸種為對(duì)照（CK），其他不同處理的浸種溶液分別為400 mg/L CeCl3、400 mg/L VC、100 μmol/L Ac-DEVD-CHO 以及VC+CeCl3、Ac-DEVD-CHO+CeCl3。不同處理對(duì)沙蔥種子浸種方法如下：蒸餾水（CK）、CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO處理的浸種方法為直接將沙蔥種子浸種6 h。VC+CeCl3、Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理的浸種方法為分別用濃度為400 mg/L VC 和100 μmol/L Ac-DEVD-CHO浸種6 h，再用400 mg/L CeCl3浸種6 h。使用6 個(gè)不同處理的方法分別對(duì)貯藏3年、5年和7年沙蔥種子進(jìn)行浸種，每處理4 次重復(fù)，每重復(fù)0.2 g 種子，浸種溶液體積為3 mL。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

分別對(duì)不同貯藏年限、不同浸種處理的沙蔥種子進(jìn)行抗氧化酶活性和有害物質(zhì)含量的測(cè)定，其中，SOD 活性、POD 活性、CAT 活性、·O2-產(chǎn)生速率、H2O2含量和MDA 含量的測(cè)定參照李合生[17]的方法；APX活性的測(cè)定參照NAKANO 等[18]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與作圖，SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子抗氧化酶活性的影響

2.1.1 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子SOD 活性的影響 由圖1 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，對(duì)照（CK）和CeCl3處理沙蔥種子的SOD 活性呈下降趨勢(shì)；VC和VC+CeCl3處理沙蔥種子的SOD 活性呈先降低后升高的趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO 處理沙蔥種子的SOD活性呈先升高后降低的趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的SOD 活性呈上升趨勢(shì)。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子SOD 活性的影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)VC、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，SOD 活性均低于CK，其中，VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理的SOD 活性與CK 相比差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)CeCl3處理后，SOD 活性高于CK，但二者差異不顯著（P＞0.05）。貯藏5年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3和Ac-DEVD-CHO 處理后，SOD 活性顯著高于CK（P＜0.05）；經(jīng)VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，SOD 活性顯著低于CK（P＜0.05）。貯藏7年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3處理后，SOD 活性均高于CK，其中，CeCl3和Ac-DEVD-CHO 處理的SOD 活性與CK 相比差異顯著（P＜0.05）；經(jīng)Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，SOD 活性低于CK，但二者差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子SOD 活性的影響

2.1.2 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子POD 活性的影響 由圖2 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，CK 和VC處理沙蔥種子的POD 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，CeCl3、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的POD 活性呈下降趨勢(shì)。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子POD 活性的影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)不同浸種處理后，POD 活性均顯著高于CK（P＜0.05）；VC 處理的POD 活性顯著低于CeCl3、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理（P＜0.05）；CeCl3、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理差異不顯著（P＞0.05）。貯藏5年的沙蔥種子經(jīng)不同浸種處理后，POD 活性與CK 相比差異不顯著（P＞0.05），但Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理的POD 活性顯著低于CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3處理（P＜0.05）。貯藏7年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3、VC、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3處理后，POD活性顯著高于CK 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理（P＜0.05）；CeCl3處理的POD 活性顯著低于VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3處理（P＜0.05）；VC、Ac-DEVD-CHO、VC+CeCl3處理差異不顯著（P＞0.05）。不同浸種處理對(duì)提高貯藏3年沙蔥種子POD 活性的效果更好。

圖2 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子POD 活性的影響

2.1.3 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子CAT 活性的影響 由圖3 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，CK、VC 和VC+CeCl3處理沙蔥種子的CAT 活性變化不大；CeCl3處理沙蔥種子的CAT 活性呈上升趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO 處理沙蔥種子的CAT 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的CAT 活性呈先降低后升高的趨勢(shì)。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子CAT 活性的影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)不同處理后，CAT活性與CK 相比差異均不顯著（P＞0.05）；貯藏5年的沙蔥種子經(jīng)Ac-DEVD-CHO 處理后，CAT 活性顯著高于CK（P＜0.05），其他浸種處理與CK 相比差異不顯著（P＞0.05）；貯藏7年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3、Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，CAT 活性顯著高于CK（P＜0.05），且Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理顯著高于CeCl3、Ac-DEVD-CHO 處理（P＜0.05）。

圖3 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子CAT 活性的影響

2.1.4 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子APX 活性的影響 由圖4 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，CK、VC 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的APX 活性呈下降趨勢(shì)；CeCl3和VC+CeCl3處理沙蔥種子的APX 活性呈先升高后降低的趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO處理沙蔥種子的APX 活性呈上升趨勢(shì)。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子APX 活性的影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)Ac-DEVD-CHO 處理后，APX 活性顯著低于CK 和其他處理（P＜0.05）；CeCl3、VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理的APX 活性與CK 相比差異不顯著（P＞0.05）。貯藏5年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3處理后，APX 活性顯著高于CK 和其他處理（P＜0.05）；Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理的APX 活性顯著低于CK（P＜0.05）。貯藏7年的沙蔥種子經(jīng)不同浸種處理后，APX 活性均顯著高于CK（P＜0.05），其中，CeCl3和Ac-DEVD-CHO 處理的APX 活性又顯著高于VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理（P＜0.05），但二者差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子APX 活性的影響

2.2 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子有害物質(zhì)的影響

2.2.1 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率的影響 由圖5 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，CK、VC、Ac-DEVD-CHO 和VC+CeCl3處理沙蔥種子的·O2-產(chǎn)生速率呈上升趨勢(shì)；CeCl3處理沙蔥種子的·O2-產(chǎn)生速率呈先升高后降低的趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的·O2-產(chǎn)生速率整體變化不明顯。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率的影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，·O2-產(chǎn)生速率顯著低于CK（P＜0.05），Ac-DEVD-CHO 處理沙蔥種子的·O2-產(chǎn)生速率顯著高于CK（P＜0.05）；貯藏5年和7年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3、VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，·O2-產(chǎn)生速率顯著低于CK（P＜0.05）。從整體來(lái)看，VC 和Ac-DEVD-CHO與CeCl3共同處理對(duì)清除沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率的效果更好。

圖5 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率的影響

2.2.2 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子H2O2含量的影響 由圖6 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，CK、CeCl3處理沙蔥種子的H2O2含量呈上升趨勢(shì)；VC 和VC+CeCl3處理沙蔥種子的H2O2含量呈下降趨勢(shì)；Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的H2O2含量整體變化不大。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子H2O2含量影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3和VC+CeCl3處理后，H2O2含量顯著高于CK（P＜0.05），其他處理沙蔥種子的H2O2含量與CK 相比差異不顯著（P＞0.05）。貯藏5年的沙蔥種子經(jīng)VC、Ac-DEVD-CHO 和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理后，H2O2含量顯著低于CK（P＜0.05）；CeCl3和VC+CeCl3處理的H2O2含量顯著高于CK（P＜0.05）。貯藏7年的沙蔥種子經(jīng)CeCl3處理后，H2O2含量顯著高于CK（P＜0.05），其他浸種處理H2O2含量顯著低于CK（P＜0.05）。

圖6 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子H2O2 含量的影響

2.2.3 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子MDA 含量的影響 由圖7 可知，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，CK、VC、VC+CeCl3和Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理沙蔥種子的MDA 含量呈上升趨勢(shì)；CeCl3和Ac-DEVD-CHO處理沙蔥種子的MDA 含量整體變化不明顯。不同浸種處理對(duì)不同貯藏年限沙蔥種子MDA 含量影響存在差異。貯藏3年的沙蔥種子經(jīng)Ac-DEVD-CHO和VC+CeCl3處理后，MDA 含量顯著高于CK（P＜0.05），其他浸種處理與CK 相比差異不顯著（P＞0.05）；貯藏5年的沙蔥種子經(jīng)VC+CeCl3處理后，MDA 含量顯著高于CK（P＜0.05），其他浸種處理與CK 相比差異不顯著（P＞0.05）；貯藏7年的沙蔥種子經(jīng)不同浸種處理后，MDA 含量與CK 相比均差異不顯著（P＞0.05）。

圖7 不同浸種處理對(duì)沙蔥種子MDA 含量的影響

3 討論與結(jié)論

種子在老化過(guò)程中，抗氧化酶活性逐漸降低[1]。有研究表明，MDA 能夠抑制植物蛋白質(zhì)合成并與蛋白質(zhì)結(jié)合，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，從而使酶鈍化后酶活性降低、植物體內(nèi)相關(guān)的生化反應(yīng)速度或能力減弱，進(jìn)而影響機(jī)體物質(zhì)的合成與分解[19]，積累自由基，發(fā)生膜脂過(guò)氧化，降低種子活力[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CeCl3處理能夠顯著提高部分貯藏年限沙蔥種子的抗氧化酶活性，這與適量Ce3+濃度能夠提高菠菜中抗氧化酶POD、CAT、SOD 活性的研究結(jié)果一致[21-22]。VC 處理能夠顯著提高部分貯藏年限沙蔥種子的抗氧化酶活性，這與VC 能顯著增強(qiáng)小麥種子內(nèi)SOD、POD、CAT 和APX 抗氧化酶活性的研究結(jié)果一致[23]。Ac-DEVD-CHO 處理能夠提高貯藏5年、7年沙蔥種子SOD 活性和貯藏3年、5年和7年沙蔥種子的POD 活性；而VC 和Ac-DEVD-CHO 與CeCl3協(xié)同處理時(shí)，反而會(huì)降低不同貯藏年限沙蔥種子的SOD活性，其中原因有待研究。

作為第二信使的活性氧（ROS），在低濃度時(shí)，能夠介導(dǎo)植物激素直接或間接地在植物細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多種應(yīng)答反應(yīng)[24]。種子老化過(guò)程中，線粒體中ROS 的爆發(fā)是誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡（PCD）的調(diào)控器[25]。隨著氧化損傷的積累，種子活力逐漸喪失，直至胚胎發(fā)生不可逆性死亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同浸種處理對(duì)降低貯藏5年和7年沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率均有促進(jìn)作用，且VC 和Ac-DEVD-CHO 與CeCl3共同處理對(duì)清除貯藏3年、5年和7年沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率的效果更好。VC 本身是一種能夠在植物體內(nèi)作為氧化脅迫防御的水溶性抗氧化劑，可直接清除·O2-、單線態(tài)氧和H2O2等活性氧的傷害，抑制膜質(zhì)過(guò)氧化[27]。Ac-DEVD-CHO 主要抑制caspase-3 酶活性，有研究表明，·O2-位于caspase-3上游[26]，因此Ac-DEVD-CHO 處理對(duì)·O2-產(chǎn)生速率的影響不大。但當(dāng)VC 與CeCl3共同處理時(shí)，·O2-產(chǎn)生速率顯著下降，說(shuō)明VC 和Ce3+能夠加強(qiáng)清除·O2-產(chǎn)生速率的能力。Ac-DEVD-CHO 本身對(duì)·O2-產(chǎn)生速率影響不大，但與CeCl3共同處理時(shí)，能顯著降低沙蔥種子·O2-產(chǎn)生速率，因?yàn)镃e3+本身能夠氧化·O2-并使其還原為H2O2[5]，從而導(dǎo)致·O2-產(chǎn)生速率降低。VC 和Ac-DEVD-CHO 處理能夠顯著降低貯藏5年和7年沙蔥種子的H2O2含量，VC 和CeCl3共同處理能夠提高貯藏3年和5年沙蔥種子的H2O2含量，Ac-DEVD-CHO+CeCl3處理則對(duì)H2O2含量起抑制作用，但與單獨(dú)使用Ac-DEVD-CHO 處理差異不大，說(shuō)明主要是Ac-DEVD-CHO 抑制了H2O2含量的產(chǎn)生，而CeCl3處理對(duì)降低H2O2含量效果不明顯。CeCl3處理會(huì)降低貯藏5年和7年沙蔥種子的MDA 含量，VC 與CeCl3協(xié)同處理時(shí)，反而導(dǎo)致MDA含量升高，其中機(jī)制有待研究。

與CK 相比，CeCl3處理能夠提高貯藏3年、5年和7年沙蔥種子的SOD 活性；與其他浸種處理相比，CeCl3處理提高SOD 活性的效果最好。與CK 相比，不同浸種處理提高了貯藏3年沙蔥種子的POD活性，提高了貯藏5年和7年沙蔥種子的CAT 活性，顯著提高了貯藏7年沙蔥種子的APX 活性。與CK 相比，不同浸種處理均能降低貯藏5年和7年沙蔥種子的·O2-產(chǎn)生速率；CeCl3處理提高了不同貯藏年限沙蔥種子的H2O2含量，Ac-DEVD-CHO 處理降低了不同貯藏年限沙蔥種子的H2O2含量，除CeCl3處理外的其他浸種處理與CK 相比均降低了貯藏7年沙蔥種子的H2O2含量；CeCl3和VC 處理降低了貯藏5年和7年沙蔥種子的MDA 含量。