苦蕎FtERD家族糖轉(zhuǎn)運基因的鑒定與分析

梁成剛, 韋春玉, 汪 燕, 關(guān)志秀, 鄧 嬌, 黃 娟, 石桃雄

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001)

植物早期脫水響應(yīng)蛋白(early responsive to dehydration,ERD)包含糖轉(zhuǎn)運蛋白[1]、泛素[2]、熱激蛋白[2]、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶[3]、ATP依賴型蛋白酶調(diào)節(jié)亞基等[4].Kiyosue et al[2]通過水分脅迫，在擬南芥中篩選到26個AtERDs克隆，并利用southern雜交將其歸為16組.劉松濤等[5]則基于干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定到5個ZmERD基因.植物ERD家族蛋白功能較為廣泛，是逆境脅迫快速響應(yīng)因子，具有調(diào)節(jié)逆境耐受性的重要作用.例如，ERD1為ClpA同源蛋白，受脫水快速誘導(dǎo)[4].ZmERD3蛋白在鹽脅迫與干旱脅迫響應(yīng)過程中起重要作用[6].同樣，擬南芥AtERD4蛋白在鹽脅迫和干旱脅迫中發(fā)揮重要作用[7-8].擬南芥AtERD6蛋白為糖轉(zhuǎn)移載體，受脫水快速誘導(dǎo)，在干旱脅迫中發(fā)揮作用[1].大豆GmERD15為轉(zhuǎn)錄因子，可在滲透脅迫下激活NRP-B表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[9].玉米ZmERD16為泛素延伸蛋白，ZmERD16啟動區(qū)域具有多個干旱、病害、光、激素等脅迫應(yīng)答元件[10].

苦蕎(Fagopyrumtararicum)是我國重要的雜糧作物，主要種植于中國西南的高寒山區(qū)[11].苦蕎主產(chǎn)區(qū)土壤貧瘠，干旱頻繁發(fā)生，在這種特殊的生長環(huán)境中，苦蕎具備了較強(qiáng)的耐貧瘠、耐干旱、耐冷涼等優(yōu)良特性[12].糖類對于植物生長發(fā)育乃至逆境響應(yīng)與耐受性等具有至關(guān)重要的作用[13].近年來調(diào)控打破糖類運輸與分配的瓶頸在作物改良中取得了重要進(jìn)展[14].植物ERD蛋白中ERD6則通過調(diào)控糖的跨膜運輸參與干旱等逆境脅迫的快速響應(yīng).目前，對作物ERD蛋白的研究工作開展相對較少，僅在少數(shù)模式作物中有報道[5,10].本試驗首次對苦蕎FtERD家族中糖轉(zhuǎn)運基因進(jìn)行篩選、鑒定與生物信息學(xué)分析，明確FtERD糖轉(zhuǎn)運基因的分類、蛋白理化特性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分析苦蕎FtERD糖轉(zhuǎn)運基因表達(dá)模式等，為苦蕎FtERD基因功能研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與樣品制備

登錄擬南芥TAIR基因庫網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp)，下載AtERDs基因序列.利用苦蕎基因組與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫，基于基因功能注釋與AtERDs同源序列分析，篩選苦蕎FtERDs基因.通過分析同源基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步篩選鑒定苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERD基因.

試驗選用苦蕎品種晉蕎麥2號為材料，在光照培養(yǎng)箱(20 ℃、25 ℃)中進(jìn)行水培種植.出苗后10 d進(jìn)行15% PEG模擬干旱處理，以不施PEG為對照，其余栽培管理措施保持一致.處理后8 h對PEG處理與對照中植株進(jìn)行取樣，迅速放于液氮中，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，供基因表達(dá)分析.

1.2 苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因序列分析

利用網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件，進(jìn)行苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)及編碼氨基酸序列查詢.利用網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件，進(jìn)行ORF編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測.利用網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件，進(jìn)行ORF編碼蛋白相對分子質(zhì)量、等電點、脂肪族氨基酸指數(shù)和疏水性預(yù)測.利用MEGA 5.0軟件Cluster W進(jìn)行多重序列分析，Neighbor-joining進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，重復(fù)次數(shù)5 000次.

1.3 苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因的表達(dá)與相關(guān)性分析

基于苦蕎出苗后5、10、15 d幼苗莖的轉(zhuǎn)錄組測序，篩選差異表達(dá)的糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因.利用MeV和SPSS 19.0軟件進(jìn)行基因的表達(dá)熱圖與相關(guān)性分析.參考RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒(DP452)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR116-02)的操作步驟進(jìn)行總RNA提取和cDNA合成.利用表1中引物進(jìn)行qRT-PCR基因定量表達(dá)檢測.具體程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，共40個循環(huán).

表1 qRT-PCR基因表達(dá)的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR of gene expression

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因及其編碼蛋白序列分析

基于苦蕎基因組與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行FtERDs基因的篩選，結(jié)果篩選出49個FtERDs基因，根據(jù)基因注釋與擬南芥同源基因比對，鑒定出28個苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因(表2).苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因序長度為2 571～8 174 bp，其中，ORF編碼蛋白FtERDs的氨基酸序列數(shù)為66～504個，分子質(zhì)量為7 532.01～54 665.75 u，理論等電點為4.48～11.77，脂肪族氨基酸指數(shù)為36.67～143.46，疏水性為-1.425～1.292.蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)19個糖轉(zhuǎn)運FtERDs蛋白序列具有跨膜結(jié)構(gòu)域，其中，F(xiàn)tPinG50564.01、FtPinG71941.01、FtPinG17078.01蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域達(dá)到6個，F(xiàn)tPinG00207.01、FtPinG50576.01、FtPinG50588.01、FtPinG63108.01、FtPinG85532.01蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域達(dá)到12個以上.

表2 苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因序列分析Table 2 Sequencing analysis of sugar transporter gene FtERDs in Tartary buckwheat

利用擬南芥AtERDs序列與FtERDs基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.結(jié)果表明，28個苦蕎FtERDs基因與擬南芥AtERDs基因可被聚為4類，類Ⅰ包括13個苦蕎FtERDs基因，類Ⅱ包括9個苦蕎FtERDs基因，類Ⅲ包括1個苦蕎FtERD基因，類Ⅳ包括5個苦蕎FtERDs基因.其中，F(xiàn)tPinG34458.01和FtPinG66513.01與擬南芥At5G18840聚為一類；FtPinG17078.01與擬南芥At3G54510聚為一類；FtPinG46455.01和FtPinG46451.01與擬南芥At1G54730聚為一類；FtPinG63108.01與擬南芥At4G35870聚為一類(圖1).

圖1 苦蕎FtERDs家族基因序列的聚類圖Fig.1 Dendrogram of sequences of FtERD gene family in Tartary buckwheat

2.2 苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因的表達(dá)分析

基于出苗后5、10、15 d苦蕎莖的轉(zhuǎn)錄組測序分析，共檢測出22個FtERDs基因在苦蕎幼苗莖中表達(dá)，包含17個差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，但其表達(dá)模式不盡一致(圖2).其中，5個DEGs的表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢，6個DEGs的表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，3個DEGs的表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢，3個DEGs的表達(dá)量呈逐漸上升趨勢.對具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的FtERDs蛋白的基因表達(dá)量進(jìn)行分析，F(xiàn)tPinG00207.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG63108.01均在苗期15 d高表達(dá)，F(xiàn)tPinG50564.01在苗期10和15 d高表達(dá)，而FtPinG85532.01在5 d高表達(dá)，而在15 d低表達(dá)，F(xiàn)tPinG17078.01和FtPinG50576.01則在3個時期均未檢測到表達(dá)量.

圖2 幼苗期苦蕎FtERDs的表達(dá)熱圖Fig.2 Heatmap of expression levels of FtERDs in Tartary buckwheat in the seedling stage

2.3 苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因的相關(guān)性分析

對22個苦蕎FtERDs基因的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析(圖3)，結(jié)果表明：FtPinG85532.01與FtPinG34458.01、FtPinG69530.01呈顯著正相關(guān)，與FtPinG46441.01、FtPinG53917.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01、FtPinG50564.01、FtPinG69533.01、FtPinG27172.01呈顯著負(fù)相關(guān)；FtPinG34458.01與FtPinG69530.01呈顯著正相關(guān)，與FtPinG46441.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01、FtPinG50564.01呈顯著負(fù)相關(guān)；FtPinG69530.01與FtPinG46441.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01、FtPinG50564.01呈顯著負(fù)相關(guān)；FtPinG23719.01與FtPinG66513.01、FtPinG27178.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG66513.01與FtPinG50691.01呈顯著正相關(guān)，與FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01呈顯著負(fù)相關(guān)；FtPinG46441.01與FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG71941.01與FtPinG50588.01、FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG50588.01與FtPinG61778.01、FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG61778.01與FtPinG53917.01、FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG53917.01與FtPinG63108.01、FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG63108.01與FtPinG78049.01、FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG78049.01與FtPinG00207.01、FtPinG78053.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG00207.01與FtPinG78053.01、FtPinG50564.01、FtPinG69533.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG50564.01與FtPinG50691.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG69533.01與FtPinG27172.01、FtPinG50691.01、FtPinG46455.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG27172.01與FtPinG50691.01、FtPinG46455.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG50691.01與FtPinG46455.01呈顯著正相關(guān)；FtPinG27178.01與FtPinG27178.01呈顯著正相關(guān).

圖3 苦蕎FtERDs基因表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of FtERDs expression in Tartary buckwheat

2.4 干旱脅迫下苦蕎糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因的表達(dá)分析

苦蕎苗期利用15% PEG進(jìn)行模擬干旱處理，選擇8個苦蕎FtERDs基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，PEG處理8 h，5個FtERDs基因的表達(dá)量均上調(diào)，倍數(shù)3.10～11.31，這些基因可能在早期干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用.另外2個FtERDs與對照差異不顯著，1個FtERD下調(diào)表達(dá)(圖4).其中FtPinG34458.01、FtPinG85532.01、FtPinG00207.01、FtPinG50588.01表達(dá)量顯著或極顯著高于對照，F(xiàn)tPinG17078.01表達(dá)量顯著低于對照.

*和**分別表示差異達(dá)到顯著或極顯著水平.圖4 PEG脅迫下苦蕎FtERDs基因表達(dá)的分析Fig.4 Analysis of FtERDs expression in Tartary buckwheat under PEG treatment

3 討論

ERD受逆境脅迫快速誘導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)逆境脅迫應(yīng)答與耐受性[1-4].ERD6是家族中被鑒定的首個糖轉(zhuǎn)運蛋白，通過介導(dǎo)糖的跨膜運輸調(diào)控植物的逆境耐受能力[1].基于苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，在49個FtERDs基因中鑒定出28個糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因.通過氨基酸序列分析表明，19個苦蕎FtERDs的ORF編碼蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域，其中，3個FtERDs蛋白具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域，5個FtERDs蛋白具有12個以上的跨膜結(jié)構(gòu)域，推測這些FtERDs編碼蛋白均能參與跨膜運輸.

ERD家族包括糖轉(zhuǎn)運蛋白、泛素、熱激蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、ATP依賴型蛋白酶調(diào)節(jié)亞基等多種蛋白[1-5].利用擬南芥AtERDs與苦蕎糖轉(zhuǎn)運AtERDs序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果表明，苦蕎28個FtERDs與15個擬南芥AtERDs基因可歸為4大類，不同類型中ERDs的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與ERD家族基因來源的廣泛性有關(guān)[2].

苦蕎幼苗發(fā)育過程中共檢測22個糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因的表達(dá)，其表達(dá)模式不盡相同，這些基因可能在幼苗不同發(fā)育時期發(fā)揮功能.例如，F(xiàn)tPinG85532.01、FtPinG34458.01、FtPinG69530.01在出苗后5 d高表達(dá)，隨后逐漸下降，這些基因可能主要在種子出苗前期發(fā)揮功能；9個糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因，包括編碼多跨膜結(jié)構(gòu)功能域的FtPinG00207.01、FtPinG71941.01、FtPinG50588.01、FtPinG63108.01基因在苗期15 d高表達(dá)，3個糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因，包括FtPinG50564.01在苗期10和15 d高表達(dá)，這些基因可能在苗期的中后期發(fā)揮功能.另外，5個糖轉(zhuǎn)運FtERDs基因在3個時期穩(wěn)定表達(dá)，這些基因可能在幼苗發(fā)育過程中持續(xù)發(fā)揮作用.相關(guān)性分析表明，苦蕎FtERDs基因間存在許多顯著正相關(guān)與負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明這些FtERDs基因間可能存在協(xié)同效應(yīng)或功能互補(bǔ)效應(yīng).

Kiyosue et al[2]首次利用干旱脅迫鑒定出26個AtERDs基因，證實AtERDs在早期響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用.苦蕎起源于中國的西南部，主要種植于高寒山區(qū)，具有較強(qiáng)的耐旱能力.本試驗利用PEG模擬干旱脅迫，在8 h后發(fā)現(xiàn)5個FtERDs基因表達(dá)量上調(diào)明顯，推測這些基因可能在響應(yīng)早期干旱脅迫過程中發(fā)揮重要作用.其中，干旱脅迫下FtPinG34458.01、FtPinG85532.01表達(dá)量極顯著高于對照組，達(dá)到10倍以上，猜測它們可能是苦蕎早期響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵基因.研究結(jié)果可為下一步深入探索FtERDs基因參與調(diào)控苦蕎干旱逆境響應(yīng)與抗旱機(jī)制提供依據(jù).