腎缺血再灌注損傷中壞死性凋亡的研究進(jìn)展

匡柏成，張季，宮念樵

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所 器官移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家衛(wèi)生健康委員會(huì)器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030)

臨床上，血容量不足、心肌梗死、腦梗死、敗血癥或器官移植等均可誘發(fā)缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。腎臟對IRI敏感，在供者器官獲取及移植手術(shù)過程中不可避免地會(huì)發(fā)生IRI，進(jìn)而導(dǎo)致術(shù)后移植物功能恢復(fù)延遲、急性或慢性排斥反應(yīng)及腎纖維化發(fā)生，嚴(yán)重影響腎移植患者預(yù)后[1]。研究者曾嘗試采用機(jī)械灌注、缺血預(yù)處理及缺血后處理、細(xì)胞治療及各種藥物制劑等干預(yù)措施，研究其對腎臟IRI的潛在保護(hù)作用，但目前臨床尚無有效方法[2-5]。

凋亡和壞死被認(rèn)為是腎IRI發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞死亡的主要形式。細(xì)胞凋亡形成凋亡小體，然后由專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬、清除，不引起炎癥反應(yīng)；而細(xì)胞壞死則會(huì)引起胞內(nèi)炎性內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[6]。隨著對細(xì)胞死亡機(jī)制研究的深入，壞死性凋亡、鐵壞死、細(xì)胞焦亡、依賴性細(xì)胞死亡等調(diào)節(jié)性細(xì)胞壞死過程逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。其中，壞死性凋亡于2005年首次提出[7]，是一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，參與調(diào)控多種急慢性疾病的發(fā)展過程。在體內(nèi)、外腎IRI模型中，壞死性凋亡通路激活，可加重腎IRI，而通過人為干預(yù)，抑制壞死性凋亡則可改善IRI后腎功能[8-10]?，F(xiàn)就腎IRI中壞死性凋亡的研究進(jìn)展予以綜述，以為臨床腎IRI的防治提供新思路。

1 壞死性凋亡概述

壞死性凋亡是一種受調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡途徑，具有細(xì)胞壞死和凋亡的混合特征。壞死性凋亡可由多種細(xì)胞內(nèi)外刺激引起，包括病毒感染和氧化應(yīng)激以及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成員、Fas配體、干擾素等[11-13]。有學(xué)者通過對細(xì)胞表面死亡受體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，對于經(jīng)胱天蛋白酶(caspase)抑制劑預(yù)處理而抑制凋亡的細(xì)胞，TNF-α仍可導(dǎo)致其死亡，且表現(xiàn)為具有細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征[14]。另有研究使用Fas配體作為刺激因素，確定了受體相互作用蛋白是caspase-8非依賴的非凋亡細(xì)胞壞死的關(guān)鍵成分[11]。2005年，Degterev等[7]首次提出“壞死性凋亡”一詞來描述這種受調(diào)控的細(xì)胞壞死模式。

2 壞死性凋亡分子機(jī)制

TNF受體是細(xì)胞表面重要的死亡受體，在壞死性凋亡的分子機(jī)制研究中，TNF-α是研究最廣泛的壞死性凋亡誘因，細(xì)胞壞死性凋亡的啟動(dòng)及執(zhí)行依賴于一系列激酶的活化，包括受體相互作用蛋白激酶(receptor-interacting protein kinase，RIPK)1、RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶(mixed lineage kinase domain like pseudokinase，MLKL)等[15](圖1)。

2.1復(fù)合物Ⅰ的形成 當(dāng)細(xì)胞受到胞內(nèi)或胞外刺激時(shí)，TNF-α與TNF受體1 結(jié)合，TNF受體1與TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用，活化并招募各種下游分子，組裝形成由TNF受體1、TNF受體1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域、TNF受體1相關(guān)因子2、RIPK1、細(xì)胞凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis protein，cIAP)1、cIAP2和線性泛素化鏈組裝復(fù)合物組成的復(fù)合物Ⅰ[16]。復(fù)合物Ⅰ作為一個(gè)反應(yīng)平臺(tái)，在決定細(xì)胞命運(yùn)方面至關(guān)重要，其中，cIAP1、cIAP2或線性泛素化鏈組裝復(fù)合物可泛素化RIPK1，泛素化的RIPK1可穩(wěn)定復(fù)合物Ⅰ，并通過招募轉(zhuǎn)化生長因子-β活化激酶1或經(jīng)經(jīng)典核因子κB通路促進(jìn)細(xì)胞存活[17]。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；TNFR1：腫瘤壞死因子受體1；RIPK：受體相互作用蛋白激酶；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子；TRADD：腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白；cIAP1/2：細(xì)胞凋亡抑制蛋白1/2；LUBAC：線性泛素化鏈組裝復(fù)合物；caspase-8：胱天蛋白酶8；FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白；MLKL：混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶；p-MLKL：磷酸化的混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶；NF-κB：核因子κB

2.2復(fù)合物 Ⅱ C的形成 當(dāng)復(fù)合物 Ⅰ 失穩(wěn)，或cIAP、轉(zhuǎn)化生長因子-β活化激酶1或核因子κB等必要調(diào)節(jié)因子消耗時(shí)，復(fù)合物Ⅰ分別形成復(fù)合物ⅡA、ⅡB，導(dǎo)致caspase激活，從而誘導(dǎo)caspase活化依賴的經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑。在caspase-8缺乏、失活或被病毒或化學(xué)抑制劑抑制，RIPK1和MLKL充分表達(dá)，或長構(gòu)型Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白樣白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白活性降低的情況下，復(fù)合物Ⅰ則形成由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的復(fù)合物ⅡC(即壞死性凋亡小體)[18]。復(fù)合物 Ⅱ C中的RIPK1和RIPK3，通過其受體相互作用蛋白同型相互作用基序相互結(jié)合，發(fā)生一系列自磷酸化和反式磷酸化反應(yīng)而活化，激活的RIPK3通過蘇氨酸357和絲氨酸358位點(diǎn)磷酸化MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域，形成磷酸化的MLKL(phosphorylated mixed lineage kinase domain like pseu-dokinase，p-MLKL)，導(dǎo)致MLKL活化[19]。

2.3壞死性凋亡的執(zhí)行 MLKL是壞死性凋亡的執(zhí)行蛋白，具有兩個(gè)功能域：N端4-螺旋束結(jié)構(gòu)域和C端RIPK3磷酸化位點(diǎn)的假激酶結(jié)構(gòu)域，兩者在功能上由兩個(gè)彎曲的螺旋線橋接。MLKL的磷酸化使MLKL發(fā)生構(gòu)象改變，激活了4-螺旋束結(jié)構(gòu)域的殺傷功能。p-MLKL寡聚并通過與質(zhì)膜磷脂酰肌醇磷酸鹽結(jié)合，從而完成由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，誘導(dǎo)細(xì)胞溶解，最終導(dǎo)致胞內(nèi)炎癥損傷相關(guān)分子模式的釋放，并促進(jìn)固有免疫和適應(yīng)性免疫發(fā)生[20]；同時(shí)，p-MLKL還可激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)(白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-18)分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[21]；此外，活化的MLKL也可被招募到線粒體膜，導(dǎo)致線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解、壞死[22]。

3 腎IRI與壞死性凋亡

盡管壞死性凋亡在一些疾病中的相對重要性仍存在爭議，但其已被報(bào)道與多種疾病密切相關(guān)，包括心臟IRI、結(jié)腸炎、腸IRI等[23-25]。壞死性凋亡可通過誘導(dǎo)細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式，促進(jìn)免疫反應(yīng)，在機(jī)體病毒感染產(chǎn)生特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞早期發(fā)揮重要的抗病毒作用[26]。此外，壞死性凋亡被認(rèn)為在多種腎損傷模型中發(fā)揮作用，包括腎IRI、順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷、造影劑腎病等[27]。

3.1腎IRI中壞死性凋亡的體內(nèi)研究 腎IRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括能量代謝障礙、腎小管壞死和凋亡、炎癥產(chǎn)生和氧化應(yīng)激等。研究表明，抗炎、抗氧化及抑制凋亡等治療均對腎IRI具有保護(hù)作用[28-29]。Linkermann等[30]于2012年首次報(bào)道了壞死性凋亡存在于腎IRI的病理損傷過程，在缺血30 min、再灌注48 h的小鼠IRI模型中，RIPK1和RIPK3表達(dá)水平顯著升高，而在缺血前15 min或再灌注后15 min給予RIPK1特異性抑制劑Nec-1(Necrostatin-1)，可顯著降低腎損傷、保護(hù)腎臟功能；同時(shí)，在致死的缺血40 min的腎IRI模型中，Nec-1可顯著降低死亡率，提高小鼠存活率。與野生型小鼠相比，RIPK3或MLKL基因敲除小鼠腎缺血30或35 min、再灌注48 h后腎功能改善[31-33]。在腎IRI時(shí)，腎臟血流障礙是腎臟功能下降的重要特征，研究者發(fā)現(xiàn)，MLKL基因敲除小鼠腎小管周毛細(xì)血管表現(xiàn)出更高的血流速度和更強(qiáng)的血流量[31]，但其具體作用機(jī)制尚不明確，因此壞死性凋亡相關(guān)基因?qū)δI臟血管的影響在腎IRI中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。Shen等[34]研究表明，在IRI前給予大鼠 Nec-1預(yù)處理可顯著降低腎臟RIPK1、RIPK3蛋白水平，抑制炎癥因子(白細(xì)胞介素-1、TNF-α及缺氧誘導(dǎo)因子1α)的表達(dá)，保護(hù)腎功能。達(dá)拉非尼是一種著名的抗癌藥物，目前已被批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤和某些非小細(xì)胞肺癌[35]。研究表明，達(dá)拉非尼也有阻斷RIPK3的作用，在缺血30 min、再灌注24 h的小鼠IRI模型中，達(dá)拉非尼預(yù)處理可明顯降低RIPK3、磷酸化的RIPK3和p-MLKL蛋白水平，減輕腎臟損傷[36-37]。

3.2腎IRI中壞死性凋亡的體外研究 細(xì)胞的糖氧剝奪模型，即細(xì)胞缺氧/復(fù)氧是模擬體內(nèi)IRI常用的體外損傷模型。Liu等[37]研究表明，人腎近端小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)缺氧/復(fù)氧損傷(缺氧24 h/復(fù)氧12 h)后，壞死性凋亡標(biāo)志物RIPK3、RIPK1、MLKL表達(dá)上調(diào)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷(缺氧2 h/復(fù)氧2、4、8 h)后p-MLKL水平降低，凋亡及自噬相關(guān)蛋白水平升高，表明細(xì)胞凋亡是缺氧/復(fù)氧損傷的主要表現(xiàn)形式，而非壞死性凋亡[38]。腎小管上皮細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度是決定細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生凋亡或壞死的主要因素[39]，因此兩者研究的差異可能與缺氧/復(fù)氧時(shí)間不同導(dǎo)致的細(xì)胞損傷程度不同有關(guān)。瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)一種非選擇性陽離子通道，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)鈣內(nèi)流和隨后氧化應(yīng)激期間的細(xì)胞損傷[40]。在HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型中，敲除TRPC6基因或給予TRPC6抑制劑可促進(jìn)RIPK1表達(dá)，加重HK-2細(xì)胞損傷[41]。Shen等[34]發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧損傷會(huì)誘導(dǎo)氧依賴的轉(zhuǎn)錄因子-缺氧誘導(dǎo)因子1α釋放，在HK-2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型中，缺氧誘導(dǎo)因子1α可間接抑制TRPC6，促進(jìn)壞死性凋亡，加重細(xì)胞損傷。

3.3壞死性凋亡參與腎IRI后腎纖維化 巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集是導(dǎo)致腎IRI后持續(xù)性炎癥和纖維化反應(yīng)的主要原因[42]，壞死性凋亡不僅參與腎IRI后急性腎小管損傷，還與腎IRI后腎小管間質(zhì)炎癥及腎纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Lau等[43]在腎移植小鼠模型中，分別通過抑制caspase-8增強(qiáng)壞死性凋亡、敲除RIPK3基因抑制壞死性凋亡發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIPK3介導(dǎo)的供腎壞死性凋亡可促進(jìn)炎癥損傷，而抑制壞死性凋亡可顯著減少中性粒細(xì)胞浸潤、腎纖維化及血管損傷，提高腎移植術(shù)后100 d無排斥存活率，對供腎存活及功能有重要影響。Chen等[44]研究表明，敲除RIPK3或MLKL基因，小鼠腎IRI后壞死性凋亡減輕，腎內(nèi)巨噬細(xì)胞的遷移和浸潤顯著減少，炎癥因子和纖維化標(biāo)志物(α平滑肌肌動(dòng)蛋白、Ⅰ型膠原蛋白)表達(dá)水平降低，腎纖維化改善。

4 腎IRI中壞死性凋亡的干預(yù)措施

在腎IRI過程中壞死性凋亡發(fā)揮重要作用，抑制壞死性凋亡可減輕IRI后腎損傷、改善腎臟功能及腎纖維化。因此，通過藥物、基因敲除或生物制劑干預(yù)，特異性阻斷壞死性凋亡通路中的關(guān)鍵分子，可用于防治腎IRI，保護(hù)腎臟功能。

4.1藥物干預(yù) 在體外使用TNF-α或去除ATP模擬的腎IRI模型中，RIPK1抑制劑Nec-1可顯著抑制壞死性凋亡，減輕腎小管細(xì)胞損傷[45]。在小鼠腎IRI體內(nèi)模型中，Nec-1可減輕腎臟病理損傷、保護(hù)腎臟功能，顯著降低IRI后小鼠死亡率[34]。研究表明，新型RIPK1抑制劑Nec-1s(Necrostatin-1 stable)較Nec-1更穩(wěn)定、不良反應(yīng)更少，且可通過抑制RIPK1的磷酸化和泛素化，對TNF-α誘導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)綜合征發(fā)揮保護(hù)作用，可抵御葉酸誘導(dǎo)的急性腎損傷[27]，但有關(guān)Nec-1s在腎IRI中的作用報(bào)道較少。甲苯磺酸索拉非尼作為RIPK1的另一種抑制劑，也對腎IRI具有保護(hù)作用[46]。此外，RIPK3抑制劑GSK843、GSK872和人特異性GSK840均能抑制TNF-α誘導(dǎo)的壞死性凋亡，但它們未在腎IRI中進(jìn)行測試[47]。目前，抑制MLKL是阻斷壞死性凋亡最明確的藥理學(xué)手段，壞死磺酰胺在體外可顯著抑制壞死性凋亡[48]，但其特異性作用于人類MLKL，在嚙齒類動(dòng)物中研究較少。

4.2基因敲除 基因敲除是常用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過人為干預(yù)使特定的基因喪失功能，進(jìn)而推測該基因的生物學(xué)作用。對基因敲除小鼠的研究支持了壞死性凋亡在腎IRI中的作用。其中，RIPK1基因全身敲除對小鼠致死，出生后存活時(shí)間不超過1～2 d[49]，故相關(guān)研究主要集中于RIPK3及MLKL基因。Linkermann等[50]在缺血43 min的致死性腎IRI模型中發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠存活率顯著升高。在標(biāo)準(zhǔn)的缺血30 min的腎IRI小鼠模型中，von M?ssenhausen等[31]通過敲除RIPK3或MLKL基因抑制壞死性凋亡，結(jié)果顯示術(shù)后小鼠腎功能改善；Newton等[32]發(fā)現(xiàn)，RIPK3基因敲除小鼠腎IRI后死亡率降低。雖然以上研究表明，通過敲除壞死性凋亡途徑的某些關(guān)鍵分子可改善腎IRI后腎功能，提高小鼠存活率，但特定敲除靶基因后對機(jī)體其他組織器官功能的影響目前尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

4.3其他 細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)通過高度精確的細(xì)胞通訊機(jī)制，對多變的外界環(huán)境做出綜合反應(yīng)，其中化學(xué)信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞通訊占重要地位。有學(xué)者通過對壞死性凋亡作用機(jī)制進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡通過上調(diào)和激活鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇通路抑制腎IRI后的壞死性凋亡，對腎IRI具有保護(hù)作用[3]。另有研究表明，重組人巨噬細(xì)胞遷移抑制因子通過升高細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽水平和減少脂質(zhì)過氧化，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗氧化作用，其可減輕腎IRI小鼠的細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡，在腎IRI模型中顯示良好的保護(hù)效果[2]。未來，通過提取與壞死性凋亡相關(guān)的細(xì)胞分泌物，如具有細(xì)胞調(diào)控作用的外泌體，可能有助于改進(jìn)調(diào)控壞死性凋亡的方案。

5 小 結(jié)

隨著新型免疫抑制劑的產(chǎn)生及手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步，腎移植術(shù)后近期存活率顯著提高，但提高移植物遠(yuǎn)期存活率仍是臨床亟待解決的難題。腎IRI影響移植物功能及患者遠(yuǎn)期預(yù)后，通過抑制壞死性凋亡，可減輕腎IRI，改善小鼠腎移植物功能，降低排斥反應(yīng)發(fā)生率，延長供腎生存時(shí)間。而壞死性凋亡在腎IRI中的作用仍需進(jìn)一步研究：①其下游作用靶點(diǎn)未完全明確；②壞死性凋亡與凋亡在腎IRI中常同時(shí)發(fā)生，腎IRI后細(xì)胞死亡的主要途徑是壞死性凋亡還是凋亡，目前尚無定論；③壞死性凋亡與其他細(xì)胞死亡途徑(如細(xì)胞焦亡、鐵死亡、依賴性細(xì)胞死亡)的聯(lián)系及在腎IRI中具體參與的程度目前尚不清楚。雖然壞死性凋亡在防御細(xì)菌和病毒感染中具有重要作用[26]，但在腎移植的情況下，抑制接受免疫抑制劑治療的受體的壞死性凋亡可能會(huì)增加感染的發(fā)生率。然而，干預(yù)壞死性凋亡可能只需在圍手術(shù)期進(jìn)行，這可能是一個(gè)短期的風(fēng)險(xiǎn)，故其確切影響需進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。