P-選擇素基因-2123C＞G、-1817T＞C與房顫合并血栓的相關(guān)性研究①

馬曉蕓，哈尼克孜·買買提衣明，居勒德孜·海拉提，馬爾加恩·巴克依，劉志強(qiáng)，木胡牙提

（1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部保健中心，2新疆醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院暨第一附屬醫(yī)院，3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心綜合心臟內(nèi)科，烏魯木齊 830054）

房顫患者并發(fā)血栓，會(huì)對(duì)其生存質(zhì)量帶來深遠(yuǎn)的影響[1-2]，對(duì)該疾病的病因進(jìn)行分析與研究十分重要。研究顯示，活化的血小板相關(guān)蛋白P-選擇素與血栓性疾病相關(guān)，然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于房顫合并血栓與P-選擇素基因多態(tài)性的研究相對(duì)較少，并且存在一定的爭(zhēng)議[3-4]。因此，本研究將探討P-選擇素基因-2123C＞G、-1817T＞C位點(diǎn)的基因多態(tài)性與房顫血栓形成的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象納入2011年8月-2020年6月間課題組流調(diào)、門診就診及住院患者和健康體檢者，均已簽署研究的知情同意書。研究對(duì)象分為房顫血栓組291例[其中男性168例，女性123例；平均年齡(60.77±12.40）歲]，房顫組534例[其中男性338例，女性196例；平均年齡(60.31±11.26）歲]，正常對(duì)照組981例[其中男性624例，女性357例，平均年齡(53.77±12.00)歲]。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1.1 房顫血栓組 （1）按照房顫指南定義[5]：無中-重度的二尖瓣狹窄或無機(jī)械性的心臟瓣膜的持續(xù)性房顫患者；（2）經(jīng)十二導(dǎo)聯(lián)的心電圖，或者24小時(shí)的動(dòng)態(tài)心電圖、心臟超聲診斷非瓣膜性心房顫動(dòng)；（3）滿足以下條件之一：a:經(jīng)食道超聲診斷左房?jī)?nèi)的血栓形成，或者左心房?jī)?nèi)的血流為泥沙樣變化；b:結(jié)合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[6]的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)CT或MRI確診為腦卒中者；（4）有自主知情能力，愿意參與研究者。

1.1.1.2 房顫組：（1）經(jīng)過詳細(xì)的病史詢問及完善CT、MRI、超聲等影像檢查，除外血栓存在；（2）余同房顫血栓組。

1.1.1.3 正常對(duì)照組 （1）在本院健康管理中心進(jìn)行體檢的健康人群；（2）詳細(xì)的病史詢問，完善十二導(dǎo)聯(lián)心電圖，或者24 h動(dòng)態(tài)心電圖、CT、MRI、超聲等影像檢查，除外房顫及血栓存在；（3）有自主知情能力，愿意參與研究者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）不能按計(jì)劃參加研究者；（2）合并有嚴(yán)重的瓣膜性的心臟病、免疫系統(tǒng)疾?。òL(fēng)濕性疾?。?、各種急/慢性感染性疾病、慢性肝病、慢性腎病、惡性腫瘤、急性冠脈綜合征等；（3）近期有口服避孕藥物、利尿劑及其他藥物等；（4）其他原因不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的。

1.2 內(nèi)容與方法

1.2.1 血液樣本收集 記錄病史、年齡、性別、吸煙、飲酒的情況、體質(zhì)指數(shù)、血壓等。清晨抽取肘部靜脈血5 mL（空腹），置于EDTA抗凝管中，放置在零下80℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 用基因組DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司，中國(guó)，北京)提取DNA。用Primer 5.0軟件(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA)設(shè)計(jì)rs1800807和rs1800808的引物（Sangon Biotech Co.中國(guó)上海）。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)進(jìn)行基因分型，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變 性 30 min，95℃ 變 性 30 s，54.7℃ (rs1800807)或56.6℃(rs800808)下退火30 s，然后在72℃延伸60 s，最后在72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與核酸內(nèi)切酶在37℃下孵育16 h，然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用遺傳平衡定律（Hardy Weinberg定律），P＞0.05提示樣本具有群體代表性。應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料則采用卡方檢驗(yàn)，采用百分率（%）來表示計(jì)數(shù)資料占總體的比率，P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Logistic回歸模型分析基因模型與疾病之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，P＜0.05認(rèn)為模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Haploview軟件分析基因的單倍體型。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)使用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)公式來分析各組的基因型頻率，3組樣本均具有群體代表性（P＞0.05），見表1、2。

表1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（-2123C＞G）

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（-1817T＞C）

2.2 P-選擇素基因多態(tài)性在各組中的分析P-選擇素的-2123C＞G位點(diǎn)和-1817T＞C位點(diǎn)的等位基因、基因型的分布、顯性基因模型、隱性基因模型進(jìn)行比較，3組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。具體基因型分布見表3。

表3 P-選擇素-2123C＞G、-1817T＞C位點(diǎn)基因型、等位基因分布/n（%）

2.3 P-選擇素基因多態(tài)性與房顫血栓相關(guān)性分析Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，房顫血栓組和房顫組比較，P-選擇素基因-2123C＞G位點(diǎn)的各遺傳模型P均＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P-選擇素基因-2123C＞G位點(diǎn)各遺傳模型對(duì)房顫患者發(fā)生血栓作用不顯著。P-選擇素基因的-1817T＞C位點(diǎn)的各基因模型P＜0.05，提示模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相對(duì)于攜帶-1817T＞C位點(diǎn)C等位基因，房顫患者攜帶T等位基因與血栓形成呈負(fù)相關(guān)（B=-0.400，OR=0.670，95%CI：0.542～0.829）；相對(duì)于攜帶CC基因型，攜帶TT基因型與血栓的形成呈 負(fù) 相 關(guān)（B=-0.891，OR=0.410，95%CI：0.259～0.651），攜帶CT基因型與血栓的形成呈負(fù)相關(guān)（B=-0.632，OR=0.532，95%CI：0.335～0.843）。房顫患者表現(xiàn)為顯性遺傳模型時(shí)，與血栓事件呈負(fù)相關(guān)（B=-0.396，OR=0.673，95%CI：0.504～0.899），表現(xiàn)為隱性基因遺傳模型時(shí)，與血栓事件呈正相關(guān)（B=0.764，OR=2.147，95%CI：1.390～3.316），具體見表4。

表4 房顫血栓組、房顫組的基因型頻率和等位基因頻率的Logistic回歸分析

2.4 P-選擇素基因的單倍型分析本研究使用Haploview軟件對(duì)P-選擇素基因-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C位點(diǎn)（rs1800808）進(jìn)行單體型分析，排除頻率小于3%的罕見單體型，分析P-選擇素的-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C位點(diǎn)（rs1800808）依次構(gòu)成的單體型，有4種單體型的頻率納入分析，分別為CC、CT、GC、GT。在房顫血栓組和房顫組比較中，攜CC（-2123C＞G/-1817T＞C）單體型優(yōu)勢(shì)比（OR=1.378，95%CI：1.047～1.814），GC 單體型優(yōu)勢(shì)比（OR=1.373，95%CI：1.059～1.781），提示 CC（-2123C＞G/-1817T＞C）、GC（-2123C＞G/-1817T＞C）單體型可能增加房顫患者血栓事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，見表5。

表5 房顫血栓組、房顫組的-2123C＞G/-1817T＞C位點(diǎn)的單倍體分析

3 討論

房顫作為心內(nèi)科的常見病、流行病[7]，其嚴(yán)重的臨床結(jié)局是血栓栓塞的形成，房顫患者并發(fā)左房的血栓，栓子可能脫落造成全身血栓栓塞，使致殘率、致死率增高。在中國(guó)，房顫患者血栓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)是非房顫患者的4～5倍，與各種原因相關(guān)的死亡風(fēng)險(xiǎn)是其他原因的2倍[8]。房顫患者并發(fā)腦卒中的幾率每年為4.9%～6.9%，且與年齡的增加相關(guān)，臨床上20%～30%的腦卒中歸因于房顫[9-10]。胡大一等[11]的研究表明，中國(guó)人群中房顫合并腦卒中的患病率為24.81%。

目前房顫相關(guān)性血栓的發(fā)病機(jī)制仍未明確，有研究表明P-選擇素基因存在多態(tài)性，且有地域的差異[12-13]。關(guān)于P-選擇素基因多態(tài)性和疾病的關(guān)聯(lián)性，國(guó)內(nèi)外的研究大部分是和冠心病、心肌梗死、靜脈血栓相關(guān)，P-選擇素基因多態(tài)性和房顫的研究較少。前期本課題組研究發(fā)現(xiàn)P-選擇素與房顫血栓發(fā)生相關(guān)[14-16]。曾國(guó)良[3]發(fā)現(xiàn)在非瓣膜性房顫患者中，存在P-選擇素-2123C/G、-1817T/C基因的多態(tài)性，且P-選擇素-2123C/G基因中的G等位基因也許是房顫合并血栓的一個(gè)致病基因，而C等位基因也許是該疾病的保護(hù)基因。然而，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也存在爭(zhēng)議，曾國(guó)良[3]研究結(jié)果表明，-1817C/T的各基因型和房顫血栓事件的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。張德凱[4]也發(fā)現(xiàn)-2123C/G、-1817C/T的基因多態(tài)性與房顫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性。李滔等[17]則發(fā)現(xiàn)P-選擇素的基因Ser290Asn位點(diǎn)的多態(tài)性不是缺血性的腦卒中的發(fā)病危險(xiǎn)因素。

從以上的結(jié)果來看，在血栓形成的事件中，P-選擇素基因的多態(tài)性發(fā)揮著重要的作用，因仍存在爭(zhēng)議，本課題研究在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究房顫患者及房顫合并血栓患者P-選擇素基因-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C（rs1800808）兩個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性，結(jié)果顯示：3組比較，P-選擇素的-2123C＞G、-1817T＞C位點(diǎn)的等位基因、基因型的分布及顯性模型、隱性模型的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；房顫血栓組的P-選擇素-2123C＞G的G等位基因、GG基因型比例較房顫組、正常對(duì)照組增高。房顫組P-選擇素-1817T＞C的T等位基因、TT基因型比例較房顫血栓組、正常對(duì)照組高。進(jìn)一步行Logistic回歸分析，P-選擇素基因-2123C＞G位點(diǎn)各遺傳模型對(duì)房顫患者發(fā)生血栓作用不顯著。而-1817T＞C位點(diǎn)中房顫患者表現(xiàn)為隱性模型時(shí)發(fā)生血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)是2.147倍，提示P-選擇素的基因-2123C＞G、-1817T＞C位點(diǎn)存在多態(tài)性，也許是房顫血栓形成的危險(xiǎn)因素。這也從另一個(gè)角度證實(shí)了，SNP在不同地域、不同個(gè)體間有差異，引起這種差異的原因，可能是由于單一的基因的多態(tài)性效應(yīng)比較弱，基因的作用效應(yīng)和遺傳背景、環(huán)境因素、所在地區(qū)密切相關(guān)；不同基因間可能存在連鎖不平衡，會(huì)影響結(jié)果的一致性；此外還有統(tǒng)計(jì)方法的差異；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的差異，如樣本量不足、不嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、抽樣誤差等。

相對(duì)于分析基因的多態(tài)性，對(duì)疾病和基因單體型的分析，有助于確定疾病致病的候選基因及其周圍的染色體在疾病發(fā)生過程中的相關(guān)作用，或者發(fā)現(xiàn)與疾病有關(guān)的遺傳學(xué)標(biāo)志。Cihan等[18]評(píng)估了P-選擇素的四個(gè)單核苷酸的多態(tài)性（SNPs）：?jiǎn)?dòng)子區(qū)域（c.2123C＞G），編碼區(qū)（S290N，c.1087G＞A；D562N，c.1902G＞A；T715P，c.2363A＞C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中最常見的單倍型是CGGA，血栓組最常見的單倍型是GGAA，與CGGA相比，部分單倍型增加了深靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)。本研究對(duì)P-選擇素基因-2123C＞G（rs1800807）、-1817T＞C位點(diǎn)（rs1800808）進(jìn)行單體型分析，4種單體型分別為CC、CT、GC、GT。在房顫血栓組和房顫組比較中，攜CC單體型優(yōu)勢(shì)比（OR=1.378，95%CI：1.047～1.814），GC單體型優(yōu)勢(shì)比（OR=1.373，95%CI：1.059～1.781），提示CC、GC單體型可能使房顫患者發(fā)生血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上所述，P-選擇素基因多態(tài)性可能是房顫血栓事件的一個(gè)遺傳性標(biāo)志。目前中國(guó)對(duì)于房顫合并血栓患者的P-選擇素基因多態(tài)性的研究較少，尤其新疆地區(qū)的研究不多，了解人群的基因分布及遺傳特征，可以幫助我們解釋疾病發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，從分子水平探討房顫血栓事件的原因。P-選擇素多個(gè)位點(diǎn)都有基因多態(tài)性存在，此次僅研究了兩個(gè)位點(diǎn)，其他位點(diǎn)仍需進(jìn)一步分析，探討P-選擇素基因多態(tài)性是否存在地域性差異，以期能夠從基因?qū)用嫒グl(fā)現(xiàn)疾病、治療疾病。