pH 響應(yīng)性聚合物抗菌涂層的制備及性能研究

羅靜，戴苗，劉曉亞，李小杰

（江南大學(xué) a.合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 b.化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

醫(yī)用金屬植入材料具有機(jī)械強(qiáng)度高、抗疲勞和易加工等優(yōu)良性能，已廣泛應(yīng)用于心血管支架和骨修復(fù)等領(lǐng)域[1]。然而醫(yī)用金屬植入材料大多呈現(xiàn)生物惰性，不具備抗菌性能[2]，在植入過程中存在細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[3]。盡管經(jīng)過嚴(yán)格的消毒程序，術(shù)后患者的細(xì)菌感染率仍高達(dá)5%～35%[4]。為了減少感染率，醫(yī)生常給患者口服或靜脈注射抗生素[5]。但抗生素的過度使用可能會引起嚴(yán)重的副作用，并使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

針對細(xì)菌的生長特性，研究人員開發(fā)了一系列聚合物抗菌涂層[6-8]。其中，防污涂層采用水合作用和/或空間排斥機(jī)制來防止細(xì)菌的粘附，如聚乙二醇（PEG）[9]和兩性離子聚合物[10]。然而防污涂層通常沒有殺菌能力。一旦涂層表面有細(xì)菌粘附，將無法繼續(xù)有效抵抗細(xì)菌，少數(shù)附著的細(xì)菌最終也會生長成生物膜。殺菌涂層則通過破環(huán)細(xì)胞膜的完整性而造成細(xì)胞質(zhì)泄露的機(jī)制來殺死細(xì)菌，主要包括季銨鹽聚合物[11]和抗菌肽[12]。然而殺菌涂層存在死細(xì)菌和其他碎片積累的問題。這不僅覆蓋了殺菌活性中心，降低了對后來附著細(xì)菌的殺菌效果，還可能觸發(fā)免疫反應(yīng)或炎癥。而簡單地將防污和殺菌功能結(jié)合在一起所制備的涂層并不能充分展現(xiàn)其抗菌功能。因此近年來，越來越多的研究人員嘗試將刺激響應(yīng)性功能加入到抗菌涂層的設(shè)計(jì)中。在外部刺激的作用下，例如水合[13]、pH[14]、光照[15]、溫度[16]和鹽濃度[17]，涂層能夠?qū)崿F(xiàn)從防污到殺菌功能的切換。但外部刺激難以應(yīng)用于人體，這顯然限制了它們的應(yīng)用。徐福建等人[18]在整形外科植入材料領(lǐng)域開發(fā)了一種pH 響應(yīng)的表面。這種表面可以對細(xì)菌感染做出反映而無需外部刺激，為聚合物抗菌涂層領(lǐng)域提供了新思路。

本研究以DMAEMA-8C、MAEBA 和EHA 作為共聚單體，制備了一種季銨鹽聚合物PMQE-CHO，并利用浸涂技術(shù)將其涂覆在不銹鋼316L（SS）表面制備季銨鹽聚合物涂層SS-PMQE-CHO。隨后使用PEG-NH2對季銨鹽涂層SS-PMQE-CHO 表面進(jìn)行接枝改性，得到pH 響應(yīng)性聚合物涂層SS-PMQE-PEG。通過模擬涂層表面發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)的微環(huán)境，研究SS-PMQE-PEG 涂層在不同pH 條件下的抗菌性能。

1 試驗(yàn)

1.1 原料與試劑

試劑包括：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA，99%），上海麥克林生化科技有限公司；1-溴辛烷（99%）、4-羥基苯甲醛（98%）、2-溴乙醇（96%）、甲基丙烯酰氯（95%）、甲基丙烯酸異辛酯（EHA，99%）偶氮二異丁腈（AIBN，99%），阿拉丁試劑上海有限公司；端氨基聚乙二醇（PEG-NH2），西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；碳酸鉀（K2CO3，AR）、氯化鈉（NaCl，CP）、無水硫酸鎂（MgSO4，AR）、三乙胺（Et3N，CP）、乙腈（CH3CN，CP）、石油醚（AR）、乙酸乙酯（AR）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，AR）、二氯甲烷（DCM，AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠（200-300 目），青島海洋化工有限公司。

原料采用316L 不銹鋼盤片（SS，直徑為3 mm，厚度為0.3 mm，博美金屬材料有限公司），依次用400目和2000 目砂紙打磨，經(jīng)乙醇和丙酮清洗后待用。

1.2 試驗(yàn)過程

1.2.1 DMAEMA-8C 的合成

參照文獻(xiàn)[19]中的制備方法，將 1-溴辛烷與DMAEMA 按照物質(zhì)的量比為1.1∶1 添加至燒瓶中，加入乙腈作為溶劑（0.65 g/mL）?；旌衔镌?0 ℃下攪拌2 d。將所得到的溶液濃縮后，于無水乙醚中沉淀3 次，并在室溫下真空干燥，得到白色粉末DMAEMA-8C，產(chǎn)率約為97.3%。DMAEMA-8C 的合成路線見圖1。

圖1 DMAEMA-8C 的合成路線Fig.1 Synthesis route of DMAEMA-8C

1.2.2 HEBA 的合成

參照文獻(xiàn)[20]中的制備方法，利用1 L 的燒瓶，將4-羥基苯甲醛（20.0 g，0.163 mol）溶解在500 mL DMF 中。在機(jī)械攪拌期間，依次加入碳酸鉀（68.0 g，0.492 mol）和2-溴乙醇（20.5 g，0.163 mol）。使混合物在120 ℃的氮?dú)夥諊蟹磻?yīng)36 h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物過濾濃縮，利用DCM 和飽和氯化鈉水溶液進(jìn)行萃取。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥處理，經(jīng)濃縮得到的粗產(chǎn)物為橘色固體。粗產(chǎn)物通過柱層析法純化（SiO2，石油醚-乙酸乙酯（1∶1））后，得到白色固體HEBA，產(chǎn)率約為54.1%。

1.2.3 MAEBA 的合成

在冰水浴的條件下，將甲基丙烯酰氯（6.5 g，0.062 mol）溶解在60 mL DCM 中，配制的溶液滴加至180 mL 溶有HEBA（9.1 g，0.055 mol）和Et3N（6.6 g，0.064 mol）的DCM 中。待體系恢復(fù)至室溫后攪拌2 h。反應(yīng)結(jié)束后，有機(jī)層經(jīng)飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥，濃縮后得到的粗產(chǎn)物為橙色油狀液體。粗產(chǎn)物通過柱層析法純化（SiO2，石油醚-乙酸乙酯（4∶1））后，得到白色固體MAEBA，產(chǎn)率約為42.5%。HEBA 和MAEBA 的合成路線見圖2。

圖2 HEBA 和MAEBA 的合成路線Fig.2 Synthesis route of HEBA and MAEBA

1.2.4 聚合物PMQE-CHO 的合成

本文通過自由基聚合制備共聚物P(MAEBA-r-DMAEMA-8C-r-EHA)，簡稱PMQE-CHO。將MAEBA、DMAEMA-8C 和EHA 分別按照物質(zhì)的量比為3∶2∶5 以及4∶1∶5 溶解在DMF 中（0.1 g/mL），并加入1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的AIBN 作為引發(fā)劑，通過冷凍-抽氣-融化三次循環(huán)，將反應(yīng)體系置換成氮?dú)夥諊?，?5 ℃下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液濃縮，于乙醚中沉淀3 次，經(jīng)50 ℃真空干燥后，得到白色固體，分別命名為PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40。共聚物PMQE-CHO 的合成路線見圖3。

圖3 共聚物PMQE-CHO 的合成路線Fig.3 Synthesis route of copolymer PMQE-CHO

1.2.5 涂層的制備

將SS 圓盤浸入PMQE-CHO-30 的DMC 溶液（0.3 g/mL）中60 s，然后取出，在空氣中干燥30 s，將該操作重復(fù)3 次得到SS-PMQE-CHO-30 涂層。將SSPMQE-CHO-30 涂層浸入PEG-NH2（Mw=2000 Da）的PBS 溶液（10 mg/mL）中，并在30 ℃下攪拌36 h。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)去離子洗滌，待自然干燥后，得到SS-PMQE-PEG-30 涂層。將SS-PMQE-PEG-30 涂層在HAc-NaAc 緩沖液（pH=5.0）中浸泡24 h，經(jīng)去離子洗滌，待自然干燥后，得到SS-PMQE-RE-30，席夫堿基團(tuán)的pH 響應(yīng)性見圖4。涂層SS-PMQE-CHO-40、SS-PMQE-PEG-40 和SS-PMQE-RE-40 的制備過程與上述相同。

圖4 席夫堿基團(tuán)的pH 響應(yīng)性Fig.4 The pH responsiveness of schiff base group

1.3 測試與表征

1.3.1 物理化學(xué)性質(zhì)

采用瑞士布魯克公司的 AVANCE Ⅲ NMR 400 MHz 核磁共振儀對 DMAEMA-8C、HEBA、MAEBA、PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40 進(jìn)行1H NMR 表征，以氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲亞砜（DMSO-d6）為溶劑。采用美國賽默飛公司的ESCALAB MK II X 射線光電子能譜（XPS）測試涂層表面的化學(xué)成分。采用日本日立株式會社S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM）對SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQE-PEG-30、SS-PMQE-CHO-40 和SS-PMQEPEG-40 的表面形貌進(jìn)行表征。采用香港基恩士有限公司的VHX1000C 超景深三維顯微鏡觀察涂層的粗糙程度。采用德國Dataphysics 公司的OCA15EC 視頻光學(xué)接觸角測量儀對涂層的親疏水性進(jìn)行測量。

1.3.2 涂層的防污和殺菌性能

所有樣品均在紫外燈下滅菌40 min。借助熒光標(biāo)記牛血清白蛋白（FITC-BSA，Solarbio）研究防污性能[18]。先將涂層在37 ℃的PBS 中浸泡2 h，然后轉(zhuǎn)移至含有0.25 mg/mL FITC-BSA 的PBS 中，并在37 ℃下黑暗孵育2 h。洗滌干燥后，通過熒光顯微鏡（日本 Nikon 80i）觀察粘附在涂層表面的 FITCBSA。

選用大腸桿菌作為代表性菌研究防污和殺菌性能。將樣品置于96 孔板中，分別加入200 μL 的細(xì)菌懸浮液（大腸桿菌ATCC 8739，108CFU/mL，PBS），在37 ℃下孵育10 h。隨后將樣品輕輕洗滌，并用SYTO 9 和PI 染色。通過激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡TCS SP8）觀察涂層表面細(xì)菌的狀態(tài)，并進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3.3 涂層的防污殺菌轉(zhuǎn)換性能

所有樣品均在紫外燈下滅菌40 min。將樣品置于96 孔板中，分別加入200 μL 細(xì)菌懸浮液（大腸桿菌ATCC 8739，105CFU/mL，LB），在37 ℃下孵育10 h或24 h。隨后將樣品輕輕洗滌，并用SYTO 9 和PI染色。通過激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡TCS SP8）觀察涂層表面細(xì)菌的狀態(tài)，并進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。為了測試涂層性能的穩(wěn)定性，將樣品在37 ℃的PBS 中孵育兩周后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 涂層的細(xì)胞相容性

1）涂層的細(xì)胞粘附性。將樣品置于24 孔板中，在L929 細(xì)胞懸液中培養(yǎng)24 h 或48 h，經(jīng)FDA/PI 溶液染色，溫育15 min 后，使用熒光顯微鏡（日本Nikon 80i）觀察細(xì)胞在樣品表面的生長狀態(tài)。

2）涂層的細(xì)胞毒性。將樣品置于24 孔板中，在DMEM 培養(yǎng)基中浸泡24 h，然后使用浸提液培養(yǎng)L929 細(xì)胞24 h 或48 h，通過MTT 法測定樣品表面所粘附細(xì)胞的相對增殖度，見式(1)。

1.3.5 溶血試驗(yàn)

將樣品置于24 孔板中，添加2 mL 稀釋后的新鮮豬血，在37 ℃下孵育1 h。將只含有PBS 緩沖液的孔作為陰性對照，含有蒸餾水的孔用作陽性對照。將懸浮液離心分離出上清液后，測量450 nm 處的吸光度，使用公式(2)計(jì)算溶血率（Hemolysis ratio，HR）。

2 結(jié)果及分析

2.1 物理化學(xué)性質(zhì)

圖5 為所制備單體DMAEMA-8C、HEBA、MAEBA 及共聚物PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40的核磁氫譜圖。如圖5d 所示，化學(xué)位移9.86×10-6、7.75×10-6、6.95×10-6處的信號峰分別歸屬于HEBA結(jié)構(gòu)中醛基Ha 以及苯環(huán)Hb 和Hc 上的質(zhì)子峰；化學(xué)位移 3.97×10-6～3.24×10-6處的信號峰歸屬于DMAEMA-8C 結(jié)構(gòu)中與季碳原子相鄰甲基Hh、亞甲基Hg 和Hi 上的質(zhì)子峰；化學(xué)位移4.92×10-6～3.95×10-6處的信號峰歸屬于共聚物結(jié)構(gòu)中與氧原子相鄰碳原子上的質(zhì)子峰Hd、He、Hf 和Hm；化學(xué)位移2.39×10-6～0.28×10-6處為共聚物主鏈以及側(cè)鏈烷基鏈上的質(zhì)子峰。通過MAEBA、DMAEMA-8C 和EHA的特征峰Ha、Hg—i 和Ho 面積進(jìn)行積分，得出共聚物PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40 中各結(jié)構(gòu)單元的比為3.0∶1.9∶5.8 和4.0∶1.4∶5.6。

圖5 各單體和共聚物的核磁氫譜圖Fig.5 1H NMR spectra of (a) DMAEMA-8C, (b) HEBA, (c) MAEBA and (d) copolymer PMQE-CHO-30 and PMQE-CHO-40

涂層的表面形貌如圖6a 和圖6b 所示。經(jīng)聚合物涂覆和PEG 改性后，涂層的表面形貌發(fā)生了輕微的變化。通過X 射線光電子能譜（XPS）分析樣品的化學(xué)組成。其中，SS、SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQEPEG-30、SS-PMQE-CHO-40 和SS-PMQE-PEG-40 的C1s 能譜圖如圖6c 所示。譜圖中284.9、289.0、286.6、284.4 eV 處出現(xiàn)的峰值分別歸因于C—C、C—O、C==O 和C—N+。與SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQECHO-40 相比，經(jīng)PEG-NH2修飾后，SS-PMQE-PEG-30和SS-PMQE-PEG-40 的C==O 峰強(qiáng)度降低，并在結(jié)合能285.6 eV 處出現(xiàn)一個(gè)新峰，這歸因于C==N 的席夫堿結(jié)構(gòu)。涂層的N1s 能譜如圖6d 所示。與不銹鋼SS相比，SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQE-CHO-40 的光譜在結(jié)合能 399.6 eV 處出現(xiàn) C—N+的新峰。經(jīng)PEG-NH2修飾后，在結(jié)合能396.7 eV 處出現(xiàn)一個(gè)新峰，這歸因于C==N 的席夫堿結(jié)構(gòu)。

圖6 SS 和涂層樣品的微觀形貌和XPS 譜圖Fig.6 (a) SEM, (b) Ultra-depth microscope images, (c, d) XPS spectra of SS and coating samples

利用C1s 譜圖中醛基與季銨鹽基團(tuán)的峰面積，計(jì)算涂層表面醛基與季銨鹽基團(tuán)的比例。共聚物PMQECHO-30 中醛基與季銨鹽的物質(zhì)的量比為1.579，但涂層SS-PMQE-CHO-30 表面[—C==O]/[C—N+]的物質(zhì)的量比為1.093，涂層表面季銨鹽基團(tuán)的含量明顯更高。這是由于季銨鹽的親水性較高，涂層浸泡在PBS溶液中時(shí)，季銨鹽基團(tuán)會遷移到涂層表面。為了計(jì)算PEG-NH2的接枝效率，利用C1s 能譜圖中的席夫堿基團(tuán)和季銨鹽基團(tuán)作比較，涂層SS-PMQE-PEG-30 表面[—C==N—]/[—C==O]的物質(zhì)的量比約為2.035，表明PEG/CHO 的物質(zhì)的量比為2.035，因此席夫堿的反應(yīng)效率是67.0%。利用同樣的方法可以計(jì)算出，涂層SS-PMQE-PEG-40 表面席夫堿的反應(yīng)效率是81.1%。

利用水接觸角（WCA）測試評估涂層表面的親疏水性。如圖7 所示，SS 的WCA 約為88.9°。經(jīng)聚合物涂覆后，疏水性增加。由于SS-PMQE-CHO-30中季銨鹽的含量高于SS-PMQE-CHO-40，所以SSPMQE-CHO-40 的疏水性相對較高。經(jīng)PEG-NH2的接枝改性后，涂層的水接觸角降低。其中，SS-PMQEPEG-40 的WCA 最小，為76.8°。

圖7 涂層表面的水接觸角Fig.7 The water contact angles of coating surface

通過國家標(biāo)準(zhǔn)測試方法測定涂層機(jī)械性能，結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1 所示。涂層厚度約為5.1～11.6 μm，附著力均達(dá)到0 級，硬度HB～2H。以上結(jié)果表明，所制備涂層結(jié)構(gòu)致密規(guī)整，機(jī)械性能優(yōu)異，有利于維持功能涂層在溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性和對基材的保護(hù)作用。

表1 涂層的厚度和硬度Tab.1 The thickness and hardness of coatings

2.2 涂層的防污和殺菌性能

為了評估涂層的防污性能，將熒光標(biāo)記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）用作蛋白質(zhì)污染的模型。利用熒光顯微鏡對涂層樣品表面蛋白質(zhì)粘附情況進(jìn)行分析，如圖8a 所示。同時(shí)基于熒光圖像，對每個(gè)樣品上BSA 的相對吸附量進(jìn)行了分析，如圖8b 所示。SS、SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQE-PEG-30、SS-PMQERE-30、SS-PMQE-CHO-40、SS-PMQE-PEG-40 和SSPMQE-RE-40 的灰度值分別為24.01、34.39、46.70、15.34、13.49、22.25 和19.43。由于蛋白質(zhì)和SS 的疏水性相互作用，SS 表面吸附了大量的BSA。與SS 表面相比，SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQE-CHO-40 表面吸附的BSA 數(shù)量有所增加。這主要是由3 種相互作用所引起的：（1）SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQECHO-40 表面的疏水性大于SS；（2）磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.2）中的BSA 帶負(fù)電，季銨鹽基團(tuán)會通過靜電相互作用吸引BSA 的粘附[21]；（3）涂層表面的醛基可以與BSA 中的氨基形成共價(jià)鍵[22]。經(jīng)過PEG 改性后，SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40表面的BSA 顯著減少。這表明SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 具有較高的防污能力。作為高度親水的聚合物，PEG 呈現(xiàn)電中性，可以通過氫鍵結(jié)合自由水分子并形成水合層以實(shí)現(xiàn)其防污性能[23]。SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 可能在PEG所形成的水合層的作用下，屏蔽了季銨鹽所帶的正電荷[18]，使得涂層具備防止蛋白粘附的性能。

圖8 涂層表面蛋白質(zhì)吸附測試的熒光圖像照片和BSA 的相對吸附量Fig.8 Representative fluorescent images of protein absorption assay (a) and relative amounts of absorbed BSA on coatings (b)

為了評估涂層的防污和殺菌性能，選用大腸桿菌作為代表性菌，以1×108CFU/mL 的高密度在PBS 中進(jìn)行測試。通過CLSM 觀察細(xì)菌在涂層表面的粘附情況，并根據(jù)CLSM 照片計(jì)算每組樣品的相對細(xì)菌數(shù)。如圖9 和圖10 所示，SS 具有疏水性，細(xì)菌易粘附在其表面。同時(shí)SS 不具備殺菌性能，因此有大量活菌在表面積聚。由于季銨鹽的存在，SS-PMQE-CHO-30和SS-PMQE-CHO-40 表現(xiàn)出一定的殺菌性能，殺菌效率分別為93%和90%，但仍有大量死細(xì)菌粘附在涂層表面。與SS 相比，在PEG 所形成的水合層的影響下，SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 對細(xì)菌具有良好的防污性能，細(xì)菌的粘附量分別減少了96%和98%。而SS-PMQE-RE-30 和SS-PMQE-RE-40 表面的PEG 在酸性條件下釋放，所以表面粘附的細(xì)菌數(shù)增加，分別表現(xiàn)出89%和87%的殺菌效率。

圖9 涂層表面大腸桿菌防污測試的CLSM 圖像Fig.9 Representative CLSM images of the antifouling test against E. coli on coatings

圖10 涂層表面大腸桿菌防污測試的定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)Fig.10 Quantitative statistical data of the antibacterial test against E. coli on coatings

防污和殺菌測試結(jié)果表明，SS-PMQE-PEG 對BSA 蛋白質(zhì)和大腸桿菌細(xì)菌具有良好的防污性能，當(dāng)PEG 從表面釋放時(shí)，其殺菌性能得以恢復(fù)。

2.3 涂層的防污殺菌轉(zhuǎn)換性能

為了研究SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40涂層的防污和殺菌轉(zhuǎn)換性能，進(jìn)行了細(xì)菌熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。利用激光共聚焦顯微鏡對涂層表面粘附的細(xì)菌進(jìn)行觀察，并利用熒光強(qiáng)度定量計(jì)算活死細(xì)菌的數(shù)量，結(jié)果如圖11 和圖12 所示。在培養(yǎng)基中孵育10 h 后，SS 表面有大量的活細(xì)菌。顯然，SS 并沒有顯示出抗菌性能。涂層SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQE-CHO-40分別表現(xiàn)出93%和90%的殺菌效率，但死細(xì)菌都聚集在涂層的表面。這會降低涂層的長效殺菌能力。而在SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 的表面幾乎沒有細(xì)菌附著，與SS 相比，細(xì)菌總數(shù)減少了94%和96%。在10 h 的孵育過程中，培養(yǎng)基中細(xì)菌的密度不足以酸化微環(huán)境，因此涂層 SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 在短期感染過程中，顯示出防污性能，以抵抗細(xì)菌的粘附。在培養(yǎng)基中孵育24 h 后，細(xì)菌代謝活躍，涂層表面的微環(huán)境呈現(xiàn)弱酸性，以破壞席夫堿結(jié)構(gòu)[24]。在這種情況下，席夫堿的斷裂會使涂層表面的PEG 釋放，從而暴露出底部的季銨鹽涂層。涂層功能由防污轉(zhuǎn)化為殺菌。此時(shí)，SS-PMQEPEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 分別顯示出93%和92%的殺菌效率。為了研究SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQEPEG-40 功能的長期穩(wěn)定性，對浸泡在PBS（pH 7.4）中兩周的SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 樣品進(jìn)行了抗菌測試。孵育10 h 后，SS-PMQE-PEG-30和SS-PMQE-PEG-40 仍顯示出良好的防污性能，與SS 相比，附著的細(xì)菌減少了93%和97%。孵育24 h后，SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 分別顯示出90%和88%的殺菌效率。這些結(jié)果表明，SS-PMQEPEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 具有防污和殺菌轉(zhuǎn)換性能，并具有長期穩(wěn)定性。

圖11 涂層樣品和在PBS 中浸泡2 周的涂層樣品在大腸桿菌懸液中分別培養(yǎng)10 h 和24 h 的抗菌測試CLSM 圖Fig.11 Representative CLSM images of the antibacterial test against E. coli cultured for 10 h and 24 h of the as-prepared samples and samples soaked in PBS for 2 weeks

圖12 涂層樣品和在PBS 中浸泡2 周的涂層樣品在大腸桿菌懸液中分別培養(yǎng)10 h 和24 h 的抗菌測試定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（插圖顯示了樣品詳細(xì)的相對細(xì)菌數(shù)）Fig.12 Quantitative statistical data of the antibacterial test against E. coli cultured for 10 h and 24 h of the as-prepared samples and samples soaked in PBS for 2 weeks (the insets show the detailed relative bacterial count of samples)

2.4 涂層的細(xì)胞相容性

醫(yī)用金屬植入材料的表面性質(zhì)對于細(xì)胞的粘附與增殖來說具有重要意義。采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（L929 細(xì)胞）作為評價(jià)涂層材料體外細(xì)胞相容性的模型細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.4.1 涂層的細(xì)胞粘附性

圖13 為L929 細(xì)胞在樣品表面分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后的熒光顯微鏡照片。培養(yǎng)24 h 后，涂層樣品表面均有細(xì)胞粘附。其中SS 作為性能優(yōu)異的醫(yī)用金屬植入材料，表面粘附有大量細(xì)胞。SS-PMQE-CHO涂層表面呈現(xiàn)出與SS 相同的生長態(tài)勢。而SS-PMQEPEG 涂層表面細(xì)胞的密度明顯降低。培養(yǎng)48 h 后，SS-PMQE-PEG 涂層樣品表面的細(xì)胞密度均有所增加，并且細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿、胞體輪廓清晰、邊緣光滑，呈健康的形貌。結(jié)果表明，所有涂層樣品均具有良好的細(xì)胞相容性，而PEG 的引入使得SS-PMQE-PEG 涂層表面親水性增加，其表面粘附的細(xì)胞數(shù)量有所降低。

圖13 L929 細(xì)胞在涂層表面培養(yǎng)24 h 和48 h 后細(xì)胞的熒光圖片F(xiàn)ig.13 Fluorescent microscopy images of L929 cells observed after 24 h and 48 h incubation on coatings

2.4.2 涂層的細(xì)胞毒性

在浸提液中培養(yǎng)24 h 和48 h 后，L929 細(xì)胞的活性如圖14a 和圖14b 所示。在培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞的活性與DMEM 中基本一致，均高于90%。細(xì)胞在SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQE-PEG-30、SS-PMQECHO-40 和SS-PMQE-PEG-40 樣品的浸提液中培養(yǎng)48 h 后，活性分別為96%、96%、101%和98%。結(jié)果表明，浸提液中無有毒物質(zhì)的釋放，或有毒物質(zhì)的含量不會對細(xì)胞生長與增殖產(chǎn)生明顯影響。

圖14 L929 細(xì)胞在涂層樣品浸提液中培養(yǎng)24 h 和48 h 后的活性測試結(jié)果Fig.14 Cell viability of L929 cells after 24 h (a) and 48 h (b) incubation in leach liquor

2.5 溶血試驗(yàn)

研究表明，季銨鹽聚合物可能會引起較高的溶血率[25]，但通過引入非離子基團(tuán)可以改善血液相容性。為了研究涂層樣品的血液相容性，進(jìn)行了溶血實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖15 所示。結(jié)果顯示，PEG 的引入的確降低了涂層的溶血率，但SS-PMQE-CHO 涂層的溶血率也小于5%。即涂層SS-PMQE-PEG 在防污殺菌行為切換前后均具有良好的血液相容性。

圖15 涂層樣品的溶血率Fig.15 The hemolysis ratio of coatings

3 結(jié)論

1）針對細(xì)菌的生長特性，通過pH 響應(yīng)性功能設(shè)計(jì)，成功將防污和殺菌功能有機(jī)結(jié)合在一起，使涂層在不同環(huán)境中能展現(xiàn)出特定的功能。在正常環(huán)境下，涂層具有良好的防污性能，可以抵抗細(xì)菌粘附并防止感染惡化。當(dāng)細(xì)菌增殖、代謝旺盛導(dǎo)致涂層表面的微環(huán)境變?yōu)槿跛嵝詴r(shí)，席夫堿結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，暴露出底部的殺菌層，涂層表面由防污轉(zhuǎn)換為滅菌，又展現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能。

2）體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，涂層具有較低的細(xì)胞毒性，細(xì)胞可以在涂層表面粘附并增殖。溶血實(shí)驗(yàn)顯示，涂層的溶血率均低于5%，具有良好的血液相容性。