當歸四逆湯對硬皮病模型大鼠HMGB1、LC3蛋白及相關炎性因子的影響

魏慧玲，王海山，楊偉娜

（1.濟南市濟鋼醫(yī)院，山東 濟南 250101；2山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，山東 濟南 250101）

硬皮病是一種常見的結締組織病，其基本表現(xiàn)為肢體、面部甚至內臟等部位出現(xiàn)皮膚增厚變性及纖維化，進而硬化和萎縮等現(xiàn)象。目前硬皮病發(fā)病原因仍不明確，相關研究認為該病可能與激素分泌異常、遺傳或體液免疫異常等因素有關[1]。高遷移率族蛋白 B1（High mobility group box 1，HMGB1）是存在于組織細胞內的高保守核蛋白。研究指出，HMGB1在皮膚組織壞死性炎性反應中有重要作用[2]。機械損傷及壞死細胞都可分泌核內HMGB1，并誘導細胞外的炎性過程；而且HMGB1能以時間劑量依賴方式促使進細胞組織白細胞介素（IL）-1、IL-17等多種炎性因子的分泌，調節(jié)免疫因子釋放，影響內皮細胞功能和免疫功能。研究顯示，當歸四逆湯在治療硬皮病方面取得了良好的效果，能夠作用于硬皮部位皮膚組織并影響炎性反應，但具體機制仍不明確[3]。本研究通過觀察當歸四逆湯對硬皮病模型大鼠免疫HMGB1蛋白的表達及腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1、IL-17 調節(jié)的影響，探討當歸四逆湯影響硬皮病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機選取Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量（180±20）g，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗造模，實驗大鼠全部由濟南大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（魯）2018-0001。

1.2 主要藥品及試劑 當歸四逆湯藥物組成：當歸12 g、桂枝 9 g、芍藥 9 g、細辛 3 g、通草 6 g、大棗 8枚、炙甘草6 g等，置于涼水中浸泡1 h，蒸煮30 min后濃縮至質量濃度為2 g/mL。醋酸潑尼松龍片（哈藥集團有限公司，國藥準字H23020185）。注射用鹽酸博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20055883）。兔抗大鼠HMGB1抗體（批號：1520-AP）、山羊抗大鼠自噬蛋白（Beclin）-1抗體（批號：9145-3-CB）和兔抗大鼠 LC3（批號：3950P）北京索萊寶科技有限公司；TNF-α ELISAKit（批號：E201609）、IL-1ELISAKit（批號：P201801）和 IL-17 ELISAKit（批號：P201812）方程生物（北京）有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模 隨機將60只大鼠分5組，每組各12只?？瞻讓φ战M大鼠不作任何處理。硬皮病大鼠模型參照文獻[4]制備：10%水合氯醛（5 mg/kg）麻醉后，大鼠背部脫毛，400 g/L鹽酸博來霉素在中央?yún)^(qū)域采用皮下注射0.1 mL，1次/d，連續(xù)4周?？瞻讓φ战M大鼠注射生理鹽水0.1 mL，1次/d，作為對照。

1.3.2 給藥 造模后第5天開始灌胃給藥，空白對照組、模型對照組給予蒸餾水5 mL/只灌胃；當歸四逆湯低、中、高劑量組分別給予4、8和16 mL/kg灌胃，1次/d，連續(xù)3周。

1.4 標本采集與檢測

1.4.1 組織學觀察 給藥結束24 h后，按照7.5 mL/kg烏拉坦麻醉并處死大鼠，變性處皮膚組織取樣2份，一部分組織置于體積分數(shù)10%多聚甲醛中固定，一部分組織置于-80℃冰箱中進行保存。將皮膚組織固定后進行石蠟包埋、組織切片，光學顯微鏡下進行組織病理學觀察，Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件檢測各組大鼠真皮和表皮厚度，統(tǒng)計并取平均值。

1.4.2 外周血細胞 TNF-α、IL-1、IL-17含量測定大鼠處死后取血10 mL，分組置于離心機中，轉速3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清液，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中TNF-α、IL-1、IL-17含量水平。

1.4.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測HMGB1、LC3及Beclin-1蛋白表達水平 取大鼠背部完整皮膚組織1 cm×1 cm，將大鼠皮膚組織加入青霉素?；福↖PA）裂解緩沖液，冰上放置30 min，蛋白測定試劑盒測定提取皮膚組織中總蛋白的濃度。用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量蛋白質，4℃下添加一抗，并與 β-肌動蛋白（β-actin）（1∶500）孵育過夜。洗滌后添加二抗（1∶500），采用能催化過氧化物酶的底物增強化學發(fā)光試劑（ECL）發(fā)光試劑顯影后，使用QuantityOne軟件分析蛋白相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩對比采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮膚組織病理學比較 PAS染色顯示，空白對照組大鼠的皮膚組織細胞清晰，上皮細胞整齊排列，無炎性浸潤；模型對照組大鼠皮膚厚度均值明顯增加，毛囊萎縮，真皮組織細胞排列錯亂；經(jīng)藥物治療后，上述炎性反應癥狀均得到緩解，見圖1～8。與空白對照組大鼠進行相比，各給藥組大鼠皮膚厚度均值出現(xiàn)升高（P＜0.05）；與模型對照組大相比，各給藥組皮膚厚度均值均出現(xiàn)降低，且當歸四逆湯治療效果對比，有明顯劑量依賴性（P＜0.01），見表1。

圖1 空白對照組

圖2 模型對照組

圖3 當歸四逆湯治療高劑量組

圖4 當歸四逆湯治療中劑量組

圖5 當歸四逆湯治療低劑量組

圖6 硬皮病高劑量組

圖7 硬皮病中劑量組

圖8 硬皮病低劑量組

表1 各組大鼠皮膚組織厚度比較 （μm，±s）

表1 各組大鼠皮膚組織厚度比較 （μm，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，◇P＜0.01。

當歸四逆湯高劑量組 12 52.18±9.33*#△◇

2.2 各組大鼠TNF-α、IL-1、IL-17含量比較 模型組大鼠與空白對照組相比，TNF-α、IL-1、IL-17含量升高（P＜0.05）；給藥組大鼠與模型對照組相比，血清中TNF-α、IL-1、IL-17含量降低，且當歸四逆湯作用有劑量依賴性（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠血清炎性因子表達比較 （ng/mL，±s）

表2 各組大鼠血清炎性因子表達比較 （ng/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.01；與中劑量組比較，◇P＜0.01。

組別 n 炎性因子表達TNF-α IL-1 IL-17空白對照組 12 0.23±0.32 0.18±0.14 0.29±0.22模型對照組 12 1.41±0.21* 1.13±0.24* 1.46±0.18*當歸四逆湯低劑量組 12 1.12±0.09# 0.88±0.13# 1.17±0.13#當歸四逆湯中劑量組 12 0.79±0.16#△ 0.69±0.12#△ 0.74±0.22#△當歸四逆湯高劑量組 12 0.49±0.22#△◇ 0.49±0.17#△◇ 0.66±0.17#△◇

2.3 各組大鼠皮膚組織中HMGB1相關蛋白表達比較 模型對照組大鼠與空白對照組相比，HMGB1、LC3、Beclin-1 蛋白表達升高（P＜0.05）；各給藥組大鼠與模型對照組相比，HMGB1蛋白表達降低，且當歸四逆湯藥物作用有劑量依賴性（P＜0.05），見圖9、表3。

圖9 皮膚組織中HMGB1、LC3相關蛋白表達情況

表3 各組大鼠皮膚組織中HMGB1相關蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠皮膚組織中HMGB1相關蛋白表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.01；與中劑量組比較，◇P＜0.01。

組別 n 皮膚組織灰度值HMGB1 LC3 Beclin-1空白對照組 12 0.112±0.052 0.179±0.112 0.189±0.074模型對照組 12 0.954±0.132* 0.820±0.255* 0.913±0.102*當歸四逆湯低劑量組 12 0.482±0.207# 0.634±0.471# 0.711±0.021#當歸四逆湯中劑量組 12 0.404±0.317#△ 0.481±0.154#△ 0.701±0.202#△當歸四逆湯高劑量組 12 0.341±0.108#△◇ 0.421±0.104#△◇ 0.459±0.211#△◇

3 討論

中醫(yī)學將硬皮病歸于“痹癥”、“虛勞”范疇，病機多與肺、脾及腎三臟功能失調有關，其本質在肺脾氣虛，病理因素包括風邪犯肺、氣血凝滯、經(jīng)絡痹阻等，治療原則當屬疏風行水、運脾通肺等[5]。當歸四逆湯出自張仲景《傷寒論》，方含當歸、芍藥、通草、桂枝、細辛、甘草、大棗等七味藥。此方是養(yǎng)血通脈、溫經(jīng)散寒的首選方，臨床常用于治療血虛寒凝證，如：凍瘡、血栓閉塞性脈管炎、無脈癥等屬者。

硬皮病發(fā)病機制涉及微循環(huán)障礙、炎性反應、代謝異常等多個方面[6-7]，有學者認為，該病是由于皮膚內自由基數(shù)量變化等因素導致成纖維細胞合成并分泌膠原增加，從而引起導致皮膚和內臟的纖維化所致。研究認為，HMGB1啟動子能夠結合自由基相關基因從而抑制其表達，且可以通過靶向抑制HMGB1蛋白表達來調控炎性因子釋放，減弱自由基誘導的硬皮病過程[8]。機體發(fā)生硬皮病時誘導炎性反應發(fā)生，外周血中白細胞種類和比例就會發(fā)生變化，免疫作用機制下，機體就會出現(xiàn)白細胞過度變化[9]。研究指出，TNF-α、IL-1、IL-17 是機體進行免疫反應的重要炎性因子，其通過調控多種細胞信號通路來干預組織的炎性反應[10-11]。當歸四逆湯對硬皮病有良好的改善和治療作用，但具體作用機制并不明確。本次研究結果顯示，通過對不同分組中大鼠外周血中血細胞成分進行分析顯示，模型對照組大鼠的TNF-α、IL-1、IL-17含量均明顯高于其他組。經(jīng)治療后，當歸四逆湯各治療組大鼠外周血TNF-α、IL-1、IL-17含量均出現(xiàn)降低，說明當歸四逆湯可能通過調控硬皮病大鼠的機體免疫改變，發(fā)揮抗炎作用。

HMGB1是一種能增強轉錄的保守核蛋白，其可對染色質結構發(fā)揮重要作用，進一步影響細胞核內的轉錄、復制、重組和基因組穩(wěn)定性。HMGB1除了核功能外，還可以作為細胞外信號分子調節(jié)免疫反應、炎性反應、自噬和癌癥[12]。Beclin-1在體內能夠特異性調節(jié)組織中自由基活動程度，對機體的炎性反應和炎性反應過程發(fā)揮重要作用[13]。研究表明，Beclin-1蛋白在胞內能夠與HMGB1蛋白特異性結合，而且HMGB1 mRNA的啟動子上能夠在結合自由基相關受體的過程中阻斷多種炎性因子的表達，進而抑制皮膚損傷過程[14-15]。而在本病過程中是否也有上述指標的改變目前尚未得到驗證。本次研究發(fā)現(xiàn)，硬皮病大鼠造模成功后，大鼠的硬皮部位皮膚皮膚組織炎性變化明顯，且硬皮部位皮膚組織中HMGB1、LC3蛋白表達水平顯著升高，這說明HMGB1蛋白表達增強，也證實HMGB1蛋白及其調節(jié)機制與硬皮病發(fā)病有相關性。并且進一步發(fā)現(xiàn)，硬皮病大鼠在當歸四逆湯治療后，其硬皮部位皮膚組織中HMGB1、LC3表達水平出現(xiàn)下降，這說明當歸四逆湯可有效降低硬皮病模型大鼠硬皮部位皮膚組織中HMGB1、LC3等相關蛋白的表達，并調節(jié)HMGB1、LC3負反饋機制，從而有效自由基釋放，抑制炎性反應，控制疾病進程。

綜上，當歸四逆湯可通過調控HMGB1、LC3等信號蛋白的表達，抑制多種炎性因子的反應進而控制硬皮病大鼠疾病進程，這可能與當歸四逆湯作用于 HMGB1、LC3蛋白的表達有關，這也提示HMGB1、LC3蛋白可能為硬皮病治療的一個新思路，下一步筆者將繼續(xù)從分子和基因角度深入探究當歸四逆湯對硬皮病的治療效果。