生漿法制作豆腐的工藝優(yōu)化

何婉瑩，黃展銳，趙良忠，劉海宇，周小虎，陳浩，周曉潔

（邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南邵陽 422000）

豆腐是大豆蛋白的高度膠凝型產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)、異黃酮、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有極高的營養(yǎng)價值，是最具開發(fā)和食用潛力的營養(yǎng)食品之一[1]。豆腐的高蛋白功效使其在國民日常膳食中起著不可或缺的作用，長期食用豆腐會減少一些常見慢性疾病的發(fā)生，例如高血壓、高血脂、冠心病、心腦血管硬化等[2,3]。

豆腐加工歷史悠久，其加工工藝多樣復(fù)雜，包括大豆浸泡、研磨、豆?jié){加熱、過濾、凝固和壓榨等工序，其中制漿是豆腐生產(chǎn)過程中的核心關(guān)鍵工序[4]。不同制漿工藝不僅對豆?jié){營養(yǎng)物質(zhì)提取率及豆?jié){穩(wěn)定性起著決定性作用，而且對豆腐品質(zhì)和風(fēng)味有顯著影響[4,5]。生漿法是將大豆勻漿液先過濾得到豆?jié){再煮沸制成豆腐的一種常用工藝方法。生漿工藝是將浸泡好的大豆磨漿，將磨好的大豆勻漿液過濾篩分離豆渣得到“生豆?jié){”，再進行加熱煮漿及后續(xù)操作制備豆腐的工藝方法，該工藝對廠房、設(shè)備等要求比較低，操作方便且效率高，是我國農(nóng)家及大部分企業(yè)生產(chǎn)豆腐最常用的制作方法[6]。

大量研究表明，豆腐產(chǎn)率高低和品質(zhì)好壞，與大豆勻漿液粗細程度、煮漿與分離先后順序、加熱溫度及時間、凝固劑添加量、凝固時間等因素密切相關(guān)[7-9]。因此，研究不同加工工藝與豆腐品質(zhì)評價指標(biāo)之間的相關(guān)性，優(yōu)化并確定最佳豆腐加工工藝參數(shù)，對豆腐生產(chǎn)者選擇豆腐加工工藝、提高豆腐出品率、改善豆腐質(zhì)構(gòu)以及實現(xiàn)豆腐自動化生產(chǎn)具有重要價值。

豆清液是大豆蛋白與凝固劑反應(yīng)而析出的上清液或豆腐在壓榨制作過程中產(chǎn)生的黃色液體。據(jù)統(tǒng)計，豆制品工廠每加工1 t黃豆會產(chǎn)生2～5 t豆清液，直接排放極易污染環(huán)境并造成資源浪費，因此合理、高效地利用豆清液已成為趨勢[10]。團隊前期研究中，豆清液經(jīng)多菌種協(xié)同發(fā)酵，制備成富含有機酸（乳酸、醋酸、檸檬酸等）和益生菌（乳酸菌、醋酸菌等）的豆清發(fā)酵液[11]。豆?jié){中大豆蛋白濃度一般低于10%，要想豆?jié){凝膠成型制作豆腐，必須加入凝固劑（例如石膏、MgCl2）促進豆?jié){蛋白形成凝膠[12,13]。近年來，豆清發(fā)酵液常用作豆腐凝固劑，其凝固機理是將豆?jié){pH調(diào)至大豆蛋白等電點附近使蛋白質(zhì)形成凝膠生產(chǎn)豆腐[14]。研究表明，豆清發(fā)酵液能提高豆腐蛋白質(zhì)及多糖提取率，通過豆清發(fā)酵液凝固制作出來的豆腐產(chǎn)品，營養(yǎng)價值高，韌性好，保水性高，風(fēng)味獨特[15,16]。

本研究基于豆清發(fā)酵液凝固蛋白制作豆腐原理，采用生漿加工工藝，以豆腐水分含量、保水性、得率和蛋白質(zhì)含量為評定指標(biāo)，研究豆水比、煮漿溫度、煮漿時間以及豆清發(fā)酵液添加量對豆腐品質(zhì)的影響，根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化實驗，在提高豆腐產(chǎn)量及蛋白質(zhì)含量基礎(chǔ)上確定最優(yōu)工藝參數(shù)，旨在為豆清發(fā)酵液豆腐標(biāo)準化工業(yè)生產(chǎn)提供有效的技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆加拿大非轉(zhuǎn)基因豆（蛋白質(zhì)含量38%），購于岳陽市萬越進出口貿(mào)易有限公司；豆清發(fā)酵液（總酸含量：4.49±0.1 g/L，蛋白酶含量：9.51±0.2 U/mL），豆制品加工與安全湖南省重點實驗提供；消泡劑（食品級），南京金鑰匙生物科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇，購于北京中遠華盾科貿(mào)有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸，購于南京化學(xué)試劑股份有限公司；甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑，購于上海振譽生物科有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MZJJ-1 0.2 t熟漿集成設(shè)備，北京康得利智能科技有限公司；EL204型電子天平，特勒-托利多儀器有限公司；UV-1780型分光光度計，北京京科瑞達科技有限公司；UDK139型凱氏定氮儀，意大利VELP公司；VELOCITY18R型臺式冷凍離心機，澳大利亞達卡米公司；GZX-9140MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗設(shè)置

以豆水比、煮漿溫度、煮漿時間和豆清發(fā)酵液添加量為單因素，按照Box-Behnken原理設(shè)計實驗方案，運用響應(yīng)面分析法建立二階多項非線性回歸方程和數(shù)據(jù)模型，以豆腐得率和蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)優(yōu)化豆腐工藝。豆水比選擇1:3、1:4、1:5、1:6、1:7（m:m）五個水平；煮漿溫度選擇95 ℃、100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃五個水平；煮漿時間選擇0 min、3 min、6 min、9 min、12 min五個水平；豆清發(fā)酵液添加量選擇15%、20%、25%、30%、35%五個水平。在確保其他因素都不變的情況下，通過控制變量法改變其中一個因素，探究該因素對豆腐得率、蛋白質(zhì)含量、保水性和水分含量的影響。

1.3.2 生漿工藝制作豆腐流程

工藝流程：

大豆→精選→洗凈→浸泡→加水磨碎→漿渣分離→（豆渣再洗凈分離）→加熱→豆?jié){→豆清發(fā)酵液點漿→凝固→破腦→壓榨→豆腐

1.3.3 豆腐得率的測定

豆腐得率參照Cai等[17]方法進行測定。每組取三份5.0 g豆腐樣品，放入恒重的稱量瓶中稱量并記錄。大豆樣品放入干燥箱中干燥（101～105 ℃）4 h后取出，在干燥器內(nèi)冷卻30 min，稱量并記錄。豆腐濕重與大豆樣品風(fēng)干重的比值即為豆腐得率（g/100 g）。

1.3.4 豆腐蛋白質(zhì)含量的測定

采用全自動凱氏定氮儀測定豆腐蛋白質(zhì)含量[11]。每組取三份2.0 g豆腐于消化管中，向管中加入催化劑（6 g K2SO4+0.4 g CuSO4·5H2O）和20 mL濃H2SO4，置于消化器上按設(shè)定程序加熱消化。消化程序為：160 ℃，30 min；420 ℃，120 min。消化至消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻，加入50 mL水。配置40% NaOH、溴甲酚綠-甲基紅指示劑、0.1 mol/L HCl吸收液于全自動凱氏定氮儀的各對應(yīng)容器中，設(shè)定程序，將消化液上機進行測定。記錄滴定數(shù)據(jù)，蛋白質(zhì)換算系數(shù)選擇6.25，根據(jù)式（1）計算豆腐蛋白質(zhì)含量。

式中：

X——樣品蛋白質(zhì)含量，%；

V1——樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準溶液體積，mL；

V2——空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準溶液體積，mL；

c——鹽酸標(biāo)準滴定溶液濃度，mol/L；

0.0140——1.0 mL鹽酸(0.1 mol/L)標(biāo)準滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；

m——樣品的質(zhì)量，g；

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)=6.25。

1.3.5 豆腐水分含量的測定

采用恒重法測定豆腐水分含量[11]。每組取三份5.0 g豆腐樣品，放入干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱量并記錄后，放在干燥箱中干燥（101～105 ℃），干燥4 h后取出，在干燥器內(nèi)冷卻30 min，重復(fù)干燥至恒重，稱量并記錄質(zhì)量。前后質(zhì)量差與豆腐質(zhì)量的比值即為水分含量。

1.3.6 豆腐保水性的測定

保水性參照Pμppo等[18]方法并稍加修改進行測定。每組取三份5.0 g豆腐樣品，放于底部有脫脂棉的50 mL離心管中，以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后稱量豆腐質(zhì)量并記錄，將稱重后的豆腐稍加粉碎置于105 ℃下干燥4 h后取出，稱量并記錄質(zhì)量。根據(jù)式（2）計算豆腐保水性。

式中：

WHC——表示豆腐保水性，%；

W1——離心后豆腐質(zhì)量，g；

W0——干燥后豆腐質(zhì)量，g。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素基礎(chǔ)上，選取豆水比、煮漿溫度、煮漿時間和豆清發(fā)酵液添加量中影響較大的因素進行響應(yīng)面試驗，以豆腐得率和蛋白質(zhì)含量為參考指標(biāo)進行試驗優(yōu)化，每組進行3次重復(fù)試驗。

1.3.8 驗證性試驗

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化方案和工藝參數(shù)設(shè)置生漿工藝優(yōu)化前后兩個試驗組制作豆腐，每組重復(fù)3次，評價實驗組之間豆腐得率和蛋白質(zhì)含量變化差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準差”表示，使用SPSS 22.0、Origin 2018和Design-Expert 8.0進行統(tǒng)計分析和方差分析，顯著和極顯著水平分別設(shè)置為p<0.05和p<0.01，以識別各組間顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 生漿工藝豆水比對豆腐品質(zhì)特性的影響

生漿工藝中不同豆水比對豆腐品質(zhì)特性的影響如圖1所示。隨著磨漿豆水比下降，豆腐得率、蛋白質(zhì)含量、水分含量和保水性均呈先增加然后減少趨勢。其中豆腐得率和蛋白質(zhì)含量在豆水比為1:4時達到最高值，且存在明顯相關(guān)性。其原因可能是磨漿水量較低時，豆?jié){中蛋白質(zhì)濃度較高，而添加一定量的豆清發(fā)酵液時，豆清發(fā)酵液中氫離子和蛋白酶與豆?jié){發(fā)生反應(yīng)，促進蛋白質(zhì)凝膠形成而提高豆腐得率[19,20]。隨著磨漿水量增高，豆?jié){中蛋白質(zhì)含量被稀釋而降低，豆清發(fā)酵液中氫離子和蛋白酶含量逐漸降低，一方面是由于蛋白質(zhì)凝膠形成不完全，導(dǎo)致豆腐得率和蛋白質(zhì)含量下降，另一方面是由于豆腐三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不致密，導(dǎo)致豆腐水分含量和保水性降低。因此選擇1:3、1:4和1:5（m:m）豆水比進行響應(yīng)面試驗用于進一步優(yōu)化。

圖1 生漿工藝中不同豆水比對豆腐品質(zhì)特性的影響Fig.1 Effects of different soybean to water ratios on tofu quality characteristics in FBBT

2.1.2 生漿工藝煮漿溫度對豆腐品質(zhì)特性的影響

生漿工藝中不同煮漿溫度對豆腐品質(zhì)特性的影響如圖2所示。豆腐得率、蛋白質(zhì)含量、水分含量和保水性隨煮漿溫度升高呈先增后降變化趨勢，其中豆腐得率在105 ℃時顯著增高并達到最大值204.33 g/100 g。其原因可能是由于煮漿溫度上升，大豆蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變，從天然的β折疊狀態(tài)變?yōu)檎归_狀態(tài)[21]，大豆蛋白親水基團充分暴露，有利于大豆蛋白溶于水[22]和蛋白粒子擴散[23,24]，從而提高豆腐得率和蛋白質(zhì)含量。當(dāng)溫度過高時，豆?jié){蛋白質(zhì)分子過度變性，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)遭受破壞，疏水基團和活性基團失活，致使豆腐三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性隨溫度增加而逐漸下降，最終導(dǎo)致豆腐各項品質(zhì)特性下降。因此選擇100 ℃、105 ℃和110 ℃煮漿溫度進行響應(yīng)面試驗用于進一步優(yōu)化。

圖2 生漿工藝中不同煮漿溫度對豆腐品質(zhì)特性的影響Fig.2 Effects of different boiling temperatures on tofu quality characteristics in FABT

2.1.3 生漿工藝煮漿時間對豆腐品質(zhì)特性的影響

生漿工藝中不同煮漿時間對豆腐品質(zhì)特性的影響如圖3所示。隨著煮漿時間延長，豆腐得率、蛋白質(zhì)含量、水分含量以及保水性均呈先增后降變化趨勢，均在6 min達到最高值，表明生漿工藝最優(yōu)煮漿時間為6 min。推測原因可能是由于煮漿時間延長（≦6 min），蛋白分子內(nèi)部的巰基和疏水性基團被暴露出來，這些基團通過二硫鍵以及疏水相互作用等形成聚集體[25]，能增強豆腐凝膠強度，從而使豆腐得率和蛋白質(zhì)含量增加，失水率減小。當(dāng)煮漿時間過長（>6 min），豆?jié){蛋白分子的疏基發(fā)生過度氧化[26]，引起豆腐三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致豆腐品質(zhì)指標(biāo)下降。因此選擇3 min、6 min、9 min煮漿時間進行響應(yīng)面試驗用于進一步優(yōu)化。

圖3 生漿工藝中不同煮漿時間對豆腐品質(zhì)特性的影響Fig.3 Effects of different boiling times on tofu quality characteristics in FABT

2.1.4 生漿工藝豆清發(fā)酵液添加量對豆腐品質(zhì)特性的影響

生漿工藝中不同豆清發(fā)酵液添加量對豆腐品質(zhì)特性的影響如圖4所示。隨著豆清發(fā)酵液添加量增多，豆腐各項品質(zhì)特性指標(biāo)均在15～25%時顯著增高（p<0.05），其原因可能是因為豆清發(fā)酵液中含有大量的乳酸等有機酸，可產(chǎn)生H+降低豆?jié){pH，而弱酸性蛋白負離子易獲取H+，降低了蛋白質(zhì)表面帶電量而呈電中性，從而構(gòu)成了較為穩(wěn)定的豆腐凝膠體系[27]。但豆腐各項品質(zhì)特性指標(biāo)均在30%～35%時略有下降，其原因可能是由于H+濃度增高，干擾了豆?jié){蛋白分子之間的凝結(jié)力，致使豆腐三維網(wǎng)絡(luò)膠凝結(jié)構(gòu)松散[28]，最終導(dǎo)致豆腐各項品質(zhì)特性指標(biāo)出現(xiàn)下降。因此選擇20%、25%、30%豆清發(fā)酵液添加量進行響應(yīng)面試驗用于進一步優(yōu)化。

圖4 生漿工藝中不同煮漿溫度對豆腐品質(zhì)特性的影響Fig.4 Effects of different FYW contents on tofu quality characteristics in FABT

2.2 豆腐生漿工藝條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

選取豆水質(zhì)量比（A）、煮漿溫度（B）、煮漿時間（C）和豆清發(fā)酵液添加量（D）4個因素3個水平進行響應(yīng)面試驗，以豆腐得率和蛋白質(zhì)含量為參考指標(biāo)進行試驗優(yōu)化，響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)置見表1。響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示，通過Design-expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到豆清發(fā)酵液豆腐得率（Y1）和蛋白質(zhì)含量（Y2）的二次多項式回歸方程為：

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Level of response surface test factors

表2 工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果表Table 2 Response surface test results of process optimisation

由表3響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析可知，豆腐得率和蛋白質(zhì)含量模型P1、P2均小于0.01，表明回歸模型影響呈極顯著（p<0.01）。失擬項P1=0.3232>0.05、P2=0.9933>0.05，可知兩個模型失擬項不顯著，表明模型可靠。實驗校正系數(shù)R12=99.29%、R22=99.46%，修正系數(shù)R12=98.57%、R22=98.92%，說明兩個方程能夠較好的反應(yīng)各個單因素之間關(guān)系，擬合度高且實驗誤差小，能分別解釋98.57%豆腐得率和98.92%豆腐蛋白質(zhì)含量響應(yīng)值變化，可用于對豆腐生漿工藝進行分析與預(yù)測。

表3 豆腐得率和蛋白質(zhì)含量響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface methodology for tofu yield and protein content

接上頁

通過分析兩個模型回歸方程及方差分析結(jié)果可知，各因素影響豆腐得率大小依次為：D（豆清發(fā)酵液添加量）>A（豆水比）>C（煮漿溫度）>B（煮漿時間）；影響豆腐蛋白質(zhì)含量大小依次：D（豆清發(fā)酵液添加量）>A（豆水比）>B（煮漿時間）>C（煮漿溫度），說明豆清發(fā)酵液添加量對豆腐得率和蛋白質(zhì)含量的影響最大，豆水比的影響其次。豆清發(fā)酵液添加量起主要作用，表明豆清發(fā)酵液決定了豆腐凝膠成型與否，當(dāng)豆清發(fā)酵液添加量過低時，不能與豆?jié){充分反應(yīng)促進凝膠成型；當(dāng)豆清發(fā)酵液添加量過高時，會引起豆清液大量析出及營養(yǎng)物質(zhì)流失，導(dǎo)致豆腐得率和蛋白質(zhì)含量下降[29,30]。

2.2.2 交互作用分析

響應(yīng)面模型可直觀地、生動地描述兩個變量（因素）之間的交互作用，表達不同變量（因素）對某一性狀指標(biāo)的影響情況。豆水比、煮漿時間、煮漿溫度和豆清發(fā)酵液添加量之間的相互作用對豆腐得率和蛋白質(zhì)含量的影響如圖5所示。由圖可知，每兩個因素相互影響總體呈拋物線型關(guān)系，均出現(xiàn)先增高后下降變化趨勢，且存在一個極值，該值即為該響應(yīng)面最優(yōu)值。同時，3D曲面圖中曲線越陡表明該因素對豆腐得率或蛋白質(zhì)含量的影響越顯著。由圖可知，A（豆水比）和D（豆清發(fā)酵液添加量）、B（煮漿時間）和C（煮漿溫度）之間的交互效應(yīng)對豆腐得率影響極顯著（p<0.01），這與回歸方程Y1中各偏回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果相吻合。B（煮漿時間）和D（豆清發(fā)酵液添加量）、C（煮漿溫度）和D（豆清發(fā)酵液添加量）之間的交互效應(yīng)對豆腐蛋白含量影響極顯著（p<0.01），這與回歸方程Y2中各偏回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果相吻合。

圖5 各兩因素交互作用對豆腐得率和蛋白質(zhì)含量影響Fig.5 Effects of the interaction of two factors on tofu yield and protein content

2.2.3 最優(yōu)條件及驗證實驗

根據(jù)Design Expert 8.0軟件得出的優(yōu)化方案，可知豆腐得率最佳工藝參數(shù)配比為：豆水比為1:4，煮漿時間為5.91 min，煮漿溫度為104.87 ℃，豆清發(fā)酵液添加量為26.44%；蛋白質(zhì)含量最佳工藝參數(shù)配比為：豆水比為1:4，煮漿時間為6.10 min，煮漿溫度為104.88 ℃，豆清發(fā)酵液添加量為26.50%。通過R2大小比較以及考慮到實際操作情況，將工藝條件改為水豆比為1:4，煮漿時間為6.0 min，煮漿溫度為105 ℃，豆清發(fā)酵液添加量為26.5%。在以上得出的最佳組合條件下設(shè)置驗證試驗并重復(fù)3次，測定豆腐得率和蛋白質(zhì)含量分別為224.09 g/100 g、8.68%，結(jié)果吻合預(yù)測值，比實驗優(yōu)化前豆腐得率提高33.15 g/100 g，蛋白質(zhì)含量提高3.29%。

3 結(jié)論

本實驗基于豆清發(fā)酵液凝固大豆蛋白原理下，研究不同工藝條件對豆腐品質(zhì)特性的影響，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定生漿工藝制作豆腐的最優(yōu)工藝條件。通過研究發(fā)現(xiàn)豆水比、煮漿溫度、煮漿時間和豆清發(fā)酵液添加量對豆腐得率及蛋白質(zhì)含量均有顯著影響，其中豆清發(fā)酵液添加量對豆腐得率和蛋白質(zhì)含量影響最顯著。在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法進行二次回歸方程擬合、方差分析和交互作用分析，確定生漿工藝制作豆腐的最佳工藝參數(shù)為豆水比1:4（kg:kg），煮漿時間6.0 min，煮漿溫度105 ℃，豆清發(fā)酵液添加量26.50%，根據(jù)以上工藝參數(shù)制作的豆腐得率和蛋白質(zhì)含量分別為224.09 g/100 g、8.68%。研究結(jié)果可為高品質(zhì)、高產(chǎn)量豆腐標(biāo)準化工業(yè)生產(chǎn)提供有效的技術(shù)支持和理論依據(jù)。