黃芪莖葉的安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)

李慧，李靜輝，崔瑩，馬德志，張可勇，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處，黑龍江齊齊哈爾 161006）

黃芪是豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.]的干燥根，在《本草綱目》中將其列為上品。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為：黃芪味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)；具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，利水消腫，斂瘡生肌的功能；用于氣虛乏力，中氣下陷，血虛萎黃等癥[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，黃芪中含黃芪多糖、皂苷類、黃酮類和多種氨基酸等主要成分，其藥理作用表現(xiàn)為提高免疫力，抗氧化、抗輻射和抗癌，保護(hù)心腦血管，提高記憶力，抗菌和抗病毒，降低血糖、血脂和減少糖尿病并發(fā)癥等作用[2]。除藥用外，黃芪常被用作食補(bǔ)的最佳原料之一，清代名醫(yī)黃宮繡的《本草求真》中稱其為“補(bǔ)氣諸藥之最”，具有極大的食用價(jià)值[3]。國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布了將黃芪按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知，研究適時(shí)將其納入食藥物質(zhì)目錄管理。

黃芪莖葉是黃芪的地上嫩莖和葉部分，應(yīng)用歷史悠久，被用于藥用和食用兩個(gè)方面。黃芪莖葉的藥用功效記載已有近2000年，始見(jiàn)于《名醫(yī)別錄》，即“莖葉主治療渴及筋攣，癰腫，疽瘡”，后有《本草綱目》和《千金翼方》中均有記載。黃芪莖葉與黃芪根化學(xué)成分相似，只是含量有所不同[4,5]。部分成分甚至高于根中的含量，楊桂明等[6]研究顯示果盛期葉中的黃芪總皂苷含量高于根中，且此時(shí)期采收地上部分對(duì)黃芪根產(chǎn)量無(wú)明顯影響。黃芪莖葉中含有黃芪甲苷，且含量高于根部[7]，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等藥理作用[8]；含有黃芪多糖，含量稍低于根部[9]，具有增強(qiáng)免疫力，提高免疫細(xì)胞的免疫活性，且具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)心血管、保肝護(hù)腎等作用[10]；含有較高含量的總黃酮，并測(cè)定了其抗氧化活性[11]，除此之外，總黃酮還具有抗腫瘤、抗突變和抗損傷的作用[12-14]。其食用歷史記載也有600多年，始見(jiàn)于《救荒本草》（公元1406年），其中黃芪莖葉食用記載為“采嫩苖葉煠熟，換水浸淘洗去苦味，油鹽調(diào)食，藥中補(bǔ)益呼為羊肉”。明代鮑山所匯輯而成的《野菜博錄》中記載：“黃芪莖葉食法，采嫩苗葉煠熟，換水浸淘去苦味，油鹽調(diào)食?！薄侗静菥V目》校點(diǎn)本上冊(cè)第2版中記載：“黃芪無(wú)毒，屬藥用植物，其莖葉花也可食用?！苯陙?lái)，我國(guó)黑龍江大興安嶺、內(nèi)蒙古等地區(qū)均有食用黃芪莖葉的歷史，已將其作為健康食品、代茶飲等食品的重要原料，并展現(xiàn)出了較好的市場(chǎng)前景。

目前關(guān)于黃芪莖葉的研究主要在有效成分及其藥理作用方面，但作為食品原料廣泛應(yīng)用的毒理學(xué)研究不夠深入，相關(guān)證據(jù)缺乏。而將黃芪莖葉作為食品原料或?qū)⑵涮崛∥镞M(jìn)行加工并研發(fā)出相關(guān)保健食品，可有效增加黃芪的附加值，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。因此，開(kāi)展其毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)尤為重要。鑒于國(guó)內(nèi)黃芪莖葉毒理學(xué)數(shù)據(jù)缺乏的現(xiàn)狀，對(duì)其開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)，為深度挖掘黃芪莖葉原料的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗(yàn)樣品采集自黑龍江齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院黃芪種植基地，樣品呈淡綠色或黃綠色，葉片為羽狀復(fù)葉。樣品處理工藝為：利用熱回流提取濃縮回收裝置對(duì)干黃芪莖葉原料進(jìn)行提取，按照料液比為1:15的比例，加水浸泡30 min，在微沸狀態(tài)下提取2次，每次2.5 h，合并提取液，過(guò)濾；濾過(guò)的殘?jiān)凑樟弦罕葹?:12的比例，加入75%的乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾。將水提和醇提的濾液合并，在70～75 ℃，負(fù)壓0.04 Mpa的條件下進(jìn)行濃縮，濃縮液利用噴霧干燥塔進(jìn)行干燥成粉末狀，干燥設(shè)置瞬時(shí)溫度180 ℃，流速2 L/h。1 g提取物粉相當(dāng)于12.50 g樣品原料。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)過(guò)程中使用的SPF級(jí)ICR小鼠和SD大鼠，均來(lái)自于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠體重20±2 g，大鼠200±20 g，均雌雄各半用于急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2014-0001，使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2014-0008；小鼠體重25～30 g，用于遺傳毒性試驗(yàn)，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2014- 0001，使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2014-0008；大鼠70±10 g，雌雄各半用于90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2014-0001，使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2016-0022。室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。

1.3 儀器與試劑

試驗(yàn)所用儀器，主要有羅氏C311全自動(dòng)生化分析儀、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，江西特康科技有限公司；OLYMPUSBH-2型顯微鏡、電子天平、解剖器械、超凈工作臺(tái)。

主要試劑包括環(huán)磷酰胺、秋水仙素、絲裂霉素、2-乙酰氨基芴、疊氮鈉以及1,8-二羥基蒽醌等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選取ICR小鼠和SD大鼠各20只，雌雄各半，按限量法設(shè)20.00 g/kg BW（相當(dāng)于干制黃芪莖葉原料250.00 g/kg BW）一個(gè)劑量組。灌胃前禁食6 h，小鼠按20 mL/kg灌胃2次，每次間隔4 h；大鼠按10 mL/kg灌胃3次，每次間隔4 h。小、大鼠末次灌胃分別2 h和3 h后恢復(fù)進(jìn)食。記錄鼠的一般狀況、中毒表現(xiàn)和死亡情況。觀察14 d，記錄試驗(yàn)初期及末期動(dòng)物體重，結(jié)束后處死動(dòng)物，進(jìn)行大體解剖檢查，記錄大體病理學(xué)變化。

1.4.2 遺傳毒性試驗(yàn)

1.4.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

選用TA97a、TA98、TA100、TA102作為試驗(yàn)菌株，以無(wú)菌DMSO將提取物粉稀釋至8、40、200、1000和5000 μg/皿的梯度，外加空白組、溶劑組和陰性對(duì)照組，在加和不加S9的條件下進(jìn)行測(cè)試，直接測(cè)定培養(yǎng)基上各菌株的回變菌落數(shù)。

1.4.2.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

選取小鼠50只，分為5組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)2.50、5.00和10.00 g/kg BW（相當(dāng)于干制黃芪莖葉原料31.25、62.50、125.00 g/kg BW）三個(gè)不同劑量組，另設(shè)一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW）和一個(gè)陰性對(duì)照組（1%羥甲基纖維素鈉）。小鼠按20 mL/kg BW經(jīng)口灌胃，共計(jì)2次，間隔24 h。灌胃結(jié)束6 h后頸椎脫臼處死，取胸骨骨髓制成骨髓片，甲醇固定，Giemsa染色。觀察每個(gè)動(dòng)物的紅細(xì)胞、嗜多染紅細(xì)胞并計(jì)數(shù)有微核嗜多染紅細(xì)胞率，采用Poisson分析法對(duì)劑量組與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。

1.4.2.3 小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

選用雄性小鼠25只，分為5組，每組5只。三個(gè)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照組、灌胃容量均與哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)設(shè)置相同，連續(xù)灌胃5 d，每天1次。于第一次灌胃后的第13 d處死小鼠，處死前5 h腹腔注射秋水仙素6 mg/kg BW。取兩側(cè)睪丸曲細(xì)精管中濾液進(jìn)行滴片、染色和鏡檢。每組觀察500個(gè)中期分裂細(xì)胞，計(jì)算各組不同類型的染色體結(jié)構(gòu)畸變頻率、常染色體單價(jià)體以及性染色體單價(jià)體等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3 90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

選擇SPF級(jí)健康大鼠100只，雌雄各半，每籠飼養(yǎng)2只大鼠。以人體推薦量的75、150、300倍設(shè)低、中、高3個(gè)劑量組（相當(dāng)于原料3.75、7.50、15.00 g/kg BW），另設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照組和2個(gè)衛(wèi)星組。試驗(yàn)組每組20只鼠，衛(wèi)星組每組10只鼠，雌雄各半。將黃芪莖葉提取物按體重8%折算摻入飼料中喂養(yǎng)，大鼠自由進(jìn)食，每周記錄大鼠體重變化情況和進(jìn)食量。試驗(yàn)中期衛(wèi)星組大鼠采尿測(cè)尿常規(guī)后禁食過(guò)夜，次日按0.50 mL/100 g BW腹腔注射8%水合氯醛麻醉，按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)處死，測(cè)定血液學(xué)與血生化指標(biāo)值。試驗(yàn)?zāi)┢诎凑罩衅谛l(wèi)星組大鼠處理方法采血處死，每只大鼠取腦、心臟、肝臟、脾臟、睪丸、卵巢等器官稱重，計(jì)算臟體比并進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則采用單因素方差分析，方差不齊進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以p<0.05作為是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

在試驗(yàn)期間，大、小鼠均無(wú)明顯中毒現(xiàn)象，無(wú)死亡情況，大體解剖各臟器均無(wú)病理性改變。干制黃芪莖葉提取物對(duì)大、小鼠經(jīng)口LD50均大于20.00 g/kg BW（相當(dāng)于干制黃芪莖葉原料250.00 g/kg BW），屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)（表1）。這與丁伯良等[15]的研究結(jié)果不同，該研究利用膜莢黃芪莖葉粉進(jìn)行小鼠毒性反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示日糧中搭配20%的莖葉粉時(shí)小鼠第32 d中毒死亡，中毒癥狀類似瘋草中毒。然而多篇文獻(xiàn)報(bào)道，蒙古黃芪和膜莢黃芪莖葉中不含有瘋草中的可導(dǎo)致中毒物質(zhì)，其產(chǎn)生的結(jié)果可能是實(shí)驗(yàn)給小鼠服用了黃芪屬中其他形態(tài)上類似于膜莢黃芪的有毒植物[16]。

表1 干制黃芪莖葉小、大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)Table 1 Acute oral toxicity of Astragalus stem and leaf in mice and rats

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

對(duì)4個(gè)試驗(yàn)菌株的回變菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不同濃度受試物的回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照數(shù)目接近，但陽(yáng)性對(duì)照組的回變數(shù)至少高于未處理對(duì)照組的2倍以上。因此，黃芪莖葉的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性，無(wú)致突變性，且兩次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同（表2）。

表2 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果Table 2 Results of bacterial reverse mutation test

2.2.2 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

與陰性對(duì)照組相比，各劑量組含微核細(xì)胞率均無(wú)顯著性差異（p>0.05），陽(yáng)性對(duì)照組則顯著高于陰性對(duì)照組，具有顯著性差異（p<0.01）。表明黃芪莖葉對(duì)小鼠骨髓紅細(xì)胞含微核細(xì)胞率未見(jiàn)明顯影響（表3）。

表3 哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of mammalian erythocyte micronucleus test

2.2.3 小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

與陰性對(duì)照組相比，各劑量組染色體異常細(xì)胞率、常染色體和性染色體早分離率均無(wú)顯著性差異（p>0.05），陽(yáng)性對(duì)照組則顯著高于陰性對(duì)照組，具有顯著性差異（p<0.01）。表明黃芪莖葉對(duì)小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)未見(jiàn)明顯影響（表4）。

表4 小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果Table 4 Results of chromosome aberration test in mouse spermatocytes

2.3 90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)期間各組動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好，未觀察到中毒表現(xiàn)和體征，大鼠眼部檢查、體重、增重、進(jìn)食量、食物利用率、血液及血生化等指標(biāo)均未見(jiàn)損害性影響，解剖及組織學(xué)觀察未見(jiàn)明顯病理組織學(xué)變化。

2.3.1 對(duì)大鼠增重、進(jìn)食量和食物利用率的影響

宮新城等[17]對(duì)母體使用黃芪莖葉胎鼠出生重及生長(zhǎng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示黃芪莖葉可以提高仔鼠的出生重和增長(zhǎng)速度，其后代體質(zhì)明顯好于對(duì)照組。從表5中可以看出不同劑量組雌雄大鼠的始重、終重、增重及食物利用率與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。

表5 干制黃芪莖葉對(duì)大鼠體重、進(jìn)食量及食物利用率的影響Table 5 Effects of Astragalus stem and leaf on body weight, food intake and food utilization of rats

2.3.2 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)和生化學(xué)指標(biāo)的影響

試驗(yàn)?zāi)┢冢鲃┝拷M大鼠與陰性對(duì)照組相比，血液學(xué)各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（p>0.05）。結(jié)果顯示黃芪莖葉對(duì)試驗(yàn)大鼠血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類等未見(jiàn)明顯影響（表6）。

表6 黃芪莖葉對(duì)大鼠血液學(xué)的影響Table 6 Effect of Astragalus stem and leaf on hematology in rats

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，雄性高劑量組大鼠AST、BUN以及雌性低劑量組大鼠TG指標(biāo)明顯低于陰性對(duì)照組（p<0.05），但其檢測(cè)值均在正常值范圍內(nèi)，其余指標(biāo)與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（p>0.05）（表7）。

表7 黃芪莖葉對(duì)大鼠血生化的影響Table 7 Effect of Astragalus stem and leaf on blood biochemistry in rats

2.3.3 對(duì)大鼠臟器重量與臟體比的影響

研究結(jié)果表明，中、高、低劑量組雌雄性別的大鼠臟器重量、臟體比數(shù)值與對(duì)照組相比，結(jié)果均未顯示有顯著差異（p>0.05）（表8）。

表8 黃芪莖葉對(duì)大鼠臟器重量和臟體比的影響（g）Table 8 Effects of Astragalus stem and leaf on visceral weight and visceral body ratio in rats

2.3.4 對(duì)大鼠尿液檢查和病理學(xué)檢查的影響

對(duì)大鼠尿液進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各組之間無(wú)顯著性差異。病理切片鏡檢顯示陰性對(duì)照組2只雄鼠、高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)胃部分腺體輕微擴(kuò)張；陰性對(duì)照組1只雌鼠、高劑量組1只雌鼠可見(jiàn)肝血管周圍少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，局灶性；高劑量組1只雄鼠、1只雌鼠可見(jiàn)肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶，局灶性；陰性對(duì)照組1只雄鼠可見(jiàn)肺血管周圍有1處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶；陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)肺邊緣有1處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶；高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)肺邊緣1處出血；陰性對(duì)照組2只雄鼠、高劑量組1只雌鼠可見(jiàn)部分腎小管上皮嗜堿性變；陰性對(duì)照組1只雄鼠可見(jiàn)腎間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)腎臟輕微腎盂腎炎，可見(jiàn)腎盂處炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，移行上皮輕微增生；高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)腎內(nèi)1處尿囊泡；陰性對(duì)照組1只雌鼠、高劑量組1只雌鼠可見(jiàn)胸腺上皮輕微增生；陰性對(duì)照組1只雌鼠可見(jiàn)卵泡單純性囊泡；陰性對(duì)照組3只雄鼠、高劑量組2只雄鼠可見(jiàn)前列腺間質(zhì)有少量炎細(xì)胞節(jié)段性浸潤(rùn)；高劑量組1只雄鼠可見(jiàn)前列腺間質(zhì)有炎細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，其余未見(jiàn)異常情況。研究結(jié)果綜合顯示，受試物未引起高劑量組雌、雄大鼠相關(guān)的病理組織學(xué)變化，以上變化均為自發(fā)病變，因此，未見(jiàn)受試物引起的動(dòng)物中毒性損傷。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，干制黃芪莖葉急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)雌雄大小鼠LD50>250.00 g/kg BW，屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。遺傳毒性試驗(yàn)（細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)）結(jié)果均為陰性，表明該樣品未顯示致突變作用。90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)顯示，試驗(yàn)期間動(dòng)物未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)和體征，大體解剖及組織學(xué)觀察也未見(jiàn)明顯與試驗(yàn)因素有關(guān)的病理組織學(xué)變化，對(duì)大鼠眼部檢查、體重、增重、進(jìn)食量和食物利用率、血液學(xué)和生化學(xué)、尿常規(guī)、臟器重量和臟體比等均無(wú)明顯損害，未觀察到有害作用劑量為15.00 g/kg BW。研究對(duì)黃芪莖葉的急性毒性，三項(xiàng)遺傳及90 d亞慢性毒性做了整體評(píng)價(jià)，為黃芪莖葉的安全性食用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，有助于黃芪的全株綜合利用研究與綜合應(yīng)用，支撐黃芪產(chǎn)業(yè)的全鏈條和高質(zhì)量開(kāi)發(fā)。