HS-SPME-GC-MS法分析栽培架式對(duì)威代爾 葡萄果實(shí)香氣的影響

張?jiān)品?，?凱，李景明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

威代爾葡萄果實(shí)是威代爾葡萄酒釀造的主要原材料之一。葡萄酒香氣的優(yōu)劣是影響消費(fèi)者接受度、葡萄酒感官品質(zhì)、葡萄酒特性的重要因素之一。影響葡萄酒感官特性的香氣化合物包括醇、酯、酸、醛、類異戊二烯、內(nèi)酯和酮[1]，共計(jì)1 300多種。這些香氣化合物的濃度、比例、類型的差異決定了葡萄酒的芳香特性[2]。

冰酒生產(chǎn)地區(qū)包括加拿大、德國、奧地利、中國等國家，中國冰酒產(chǎn)量占全球三分之一。過去十年中，Cliff等[3]為全球冰酒消費(fèi)者定義了加拿大冰酒的一些區(qū)域風(fēng)味特征。冰酒風(fēng)味研究表明，不同地區(qū)生產(chǎn)的冰酒香氣特征有很大不同[3-4]。加拿大冰酒具有較高果香，而德國冰酒具有較高的堅(jiān)果或油性香。加拿大安大略省冰酒具有很高的杏子、葡萄干、蜂蜜和橡木香氣[5]。中國威代爾冰酒具有堅(jiān)果和蜂蜜香氣的特征，通過偏最小二乘判別分析獲得的進(jìn)一步結(jié)果表明：堅(jiān)果、蜂蜜等香氣與相應(yīng)的揮發(fā)性化合物有關(guān)[6]。因此各生產(chǎn)地區(qū)環(huán)境的差異也是造成冰酒感官差異的重要原因。

生產(chǎn)地區(qū)環(huán)境的差異雖然是造成威代爾冰酒感官差異的重要原因，但只有對(duì)冰酒進(jìn)行香氣鑒定分析才能更加深入了解造成冰酒感官差異的香氣物質(zhì)的變化規(guī)律，進(jìn)而依靠同樣思路鑒定威代爾葡萄果實(shí)香氣差異原因。威代爾冰酒因其令人著迷的香氣和口感而被認(rèn)為是極高品質(zhì)的冰酒[5,7]。威代爾冰酒生產(chǎn)中，收獲冷凍的葡萄低溫壓榨，只有少量冰葡萄汁含有高濃度的糖、酸和芳香族化合物，可以進(jìn)一步加工，最終將釀造出一種富含糖、酸、色素和風(fēng)味化合物的葡萄酒。這些糖、酸、色素和風(fēng)味化合物是構(gòu)成冰酒特殊風(fēng)味的重要成分。葡萄冷凍過程中，葡萄漿果經(jīng)歷了一系列的冷凍和解凍循環(huán)，葡萄藤上的凍融事件導(dǎo)致葡萄漿果揮發(fā)性化合物及其前體的顯著改變，這賦予了冰酒一定的獨(dú)特風(fēng)味。由于部分凍結(jié)和物理應(yīng)激，加速了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[8]。

Ma Yue等[9]通過氣相色譜-嗅覺（gas chromatographyolfactometry，GC-O）法分析中國威代爾冰酒共有28 種重要香氣化合物，并進(jìn)行感官特性分析。也有研究通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）研究冰酒的感官特性，并通過GC-O測定冰酒中的氣味活性化合物[10]。威代爾冰酒某些揮發(fā)性化合物隨收獲日期、作物水平變化而變化。Bowen等[10-11]的研究表明，雷司令和威代爾冰酒中絕大多數(shù)香氣化合物濃度高于餐酒，且大多數(shù)香氣成分在調(diào)味稀薄型葡萄酒中濃度最高，而在果香稀薄型葡萄酒中濃度最低。11月和12月的凍結(jié)與解凍事件對(duì)香氣化合物的發(fā)展似乎比農(nóng)作物水平更為重要[10-11]，冰酒中的揮發(fā)性香氣化合物決定了冰酒香氣特征，識(shí)別這些揮發(fā)性化合物并分析主要?dú)馕秾?duì)總體香氣的貢獻(xiàn)對(duì)于控制冰酒的質(zhì)量尤為重要。Lan Yibin等[12]分別使用在葡萄凍融事件之前和之后采摘的葡萄制成“北冰紅”干酒和冰酒，對(duì)其進(jìn)行香氣重構(gòu)實(shí)驗(yàn)和定量描述性分析，以確認(rèn)通過GC-O和香氣活性值（odor active value，OAV）大于1識(shí)別的氣味活性化合物對(duì)葡萄酒的感官影響。

威代爾葡萄果實(shí)栽培架式的不同，最終目的是對(duì)比出更優(yōu)的栽培架式保證葡萄莖蔓空間分布更合理，使葉受光更均勻，促進(jìn)光合作用，利于葡萄成熟，最終使品質(zhì)和采收產(chǎn)量更優(yōu)。本實(shí)驗(yàn)研究棚架、籬架架式差異對(duì)威代爾果實(shí)香氣的影響，通過采集2016年的葡萄樣品，利用偏最小二乘判別分析、熱圖、雷達(dá)圖等分析方法，結(jié)合氣象數(shù)據(jù)、理化指標(biāo)、香氣監(jiān)測數(shù)據(jù)研究分析并對(duì)比架式差異帶來的影響，針對(duì)威代爾葡萄果實(shí)香氣架式研究方向提出自己的觀點(diǎn)，旨在為桓仁產(chǎn)區(qū)的葡萄栽培提供理論基礎(chǔ)與指導(dǎo)意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄栽培與采樣

威代爾葡萄為3～4 a生，采于遼寧省本溪市桓仁縣二棚甸子鎮(zhèn)四道嶺子村，生長在桓龍湖畔?；溉士h地處北緯40°25’～41°34’，東經(jīng)124°43’～125°47’，棚架與籬架均按照東西走向栽培。相比于棚架，籬架有更優(yōu)的通風(fēng)、受光、均勻成熟度、抗病蟲害，更適合機(jī)械化作業(yè)與田間管理。種植相對(duì)濕度66%，日照時(shí)數(shù)為2 538 h、年均溫7.4 ℃。屬于溫帶大陸性氣候，降水量800 mm，坡度25°，水質(zhì)上佳無污染。同時(shí)桓仁縣在12月會(huì)進(jìn)入低于－8 ℃的穩(wěn)定期。植株密度為2.5 m×1 m，對(duì)葡萄藤進(jìn)行了5～6 個(gè)枝條修剪，總作物產(chǎn)量控制在10 000 kg/hm2左右。中國氣象數(shù)據(jù)共享服務(wù)系統(tǒng)（http://cdc.cma.gov.cn/home）提供了該葡萄場在葡萄2016年份的氣象參數(shù)（平均溫度、降雨量和濕度）。

本次實(shí)驗(yàn)所用的威代爾葡萄擁有2 種栽培架式 （圖1），分別為籬架栽培架式與棚架栽培架式，且均為連體冷凍培育，棚架為水平小棚架栽培架式，籬架為廠字型架式結(jié)構(gòu)。

圖1 不同栽培架式Fig. 1 Different training systems

栽培架式的培育遵循雙蔓輪換技術(shù)原則。本實(shí)驗(yàn)采用2016年葡萄樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所取實(shí)驗(yàn)材料，遵守隨機(jī)取樣原則。每次隨機(jī)在不同地塊不同行列進(jìn)行取樣，取樣時(shí)兼顧上中下，以及陰面和陽面，每次取樣不重復(fù)樹體，所取樣品成熟度均勻，無明顯病蟲害。每次采取10 穗威代爾葡萄，樣品采集完畢后立即用液氮冷凍處理，除去主要果柄，整理標(biāo)記后置于－40 ℃冷凍保存。從2016年8月1日開始取樣，取樣時(shí)間跨度為8月1日—12月10日，共計(jì)取樣14 次。因8月1日為花后50 d，記作50，因此相應(yīng)14 個(gè)取樣點(diǎn)分別記作50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180（即12月10日，花后180 d），其中花后50～120 d稱為葡萄“成熟期”，花后130～180 d稱為葡萄“后熟期”。

1.1.2 試劑

C7～C40正構(gòu)烷烴 上海安普實(shí)驗(yàn)科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（USP級(jí)） 上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖酸內(nèi)酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 氯化鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）裝置 美國Supelco公司；RZ-708H干磨料理機(jī) 榮事達(dá)公司； 6890N型GC儀、5973型MS儀 美國Agilent公司；BSA124S-CW分析天平、PB-10型pH儀 德國塞利多斯 公司；GL-20G-II型高速冷凍離子機(jī) 海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 理化參數(shù)的確定

在測量完畢新鮮威代爾葡萄果實(shí)質(zhì)量后，將100 個(gè)威代爾葡萄果實(shí)去梗去籽后壓榨離心以進(jìn)行理化指標(biāo)檢測分析。

總可溶性固形物含量通過自動(dòng)溫度補(bǔ)償數(shù)字折光儀測定；可滴定酸度含量按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；pH值使用PB-10型pH儀測定。

1.3.2 游離態(tài)香氣化合物的分離提取

參考Chen Kai等[13]的方法，并加以修改。從－40 ℃冰箱取出約50 g每個(gè)取樣點(diǎn)的威代爾冰葡萄果實(shí)樣品，經(jīng)過去梗、去籽后放入盛有液氮的泡沫器皿中，快速冷凍。全部處理完畢后轉(zhuǎn)移至RZ-708H干磨料理機(jī)中，并加入1 g聚乙烯吡咯烷酮與0.5 gD-葡萄糖酸內(nèi)酯。使凍結(jié)的葡萄樣品在料理機(jī)中迅速干磨破碎成均質(zhì)粉末狀，后放于50 mL離心管標(biāo)記序號(hào)并在4 ℃冰箱靜置離心管浸漬4 h。浸漬結(jié)束后迅速將離心管放置在高速冷凍離心機(jī)中。隨后在4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集上層汁液置于新的50 mL離心管中，得到的樣品即游離態(tài)香氣檢測樣品。隨后置于－40 ℃冰箱中短期貯存。每個(gè)樣品做3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 頂空SPME分析

選用4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)，該成分不出現(xiàn)在樣品香氣中，出峰位置附近無干擾峰出現(xiàn)，且出現(xiàn)在組分中前部，是較為理想的內(nèi)標(biāo)物。取經(jīng)過上述游離態(tài)與結(jié)合態(tài)處理步驟后置于SPME專用玻璃樣品瓶中的樣品。加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子1 g NaCl和10 μL內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇，約213 μg/mL）于盛有樣品的SPME專用玻璃樣品瓶中，隨后擰緊瓶子，置于磁力攪拌加熱臺(tái)的加熱手柄上，平衡溫度40 ℃、平衡時(shí)間30 min。平衡結(jié)束后提前經(jīng)過8 min熱解吸以及完成活化操作的PDMS/CAR/DVB三相萃取頭插入SPME樣品瓶的頂空部分，保證萃取頭萃取部分距離樣品液面約1 cm，在40 ℃恒溫加熱以及攪拌條件下進(jìn)行30 min吸附，使SPME樣品瓶中的香氣物質(zhì)達(dá)到三相平衡，隨后將萃取頭插入GC進(jìn)樣口。進(jìn)樣口溫度250 ℃，熱解吸8 min。每個(gè)樣品做3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 GC-MS檢測

參照Lan Yibin等[12]的方法。

GC條件：HP-INNOWAX極性毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，選擇不分流模式通過SPME手動(dòng)進(jìn)樣。升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min。然后以3 ℃/min升至220 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～350 u。四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜接口溫度280 ℃；每個(gè)樣品做3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 香氣化合物的定性和定量

通過自動(dòng)解卷積與鑒定系統(tǒng)（AMDIS）計(jì)算正構(gòu)烷烴C7～C40數(shù)據(jù)文件得到正構(gòu)烷烴保留指數(shù)。對(duì)于有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣物質(zhì)，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)已建立的相同色譜條件下該化合物的保留指數(shù)和質(zhì)譜信息NIST 2014進(jìn)行定性分析。沒有標(biāo)樣的香氣物質(zhì)，利用文獻(xiàn)報(bào)道中相似色譜條件下該化合物的保留指數(shù)以及NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定性分析；對(duì)于文獻(xiàn)中未報(bào)道相似色譜條件下化合物保留指數(shù)的香氣物質(zhì)，則根據(jù)NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定性分析。

定量過程基于實(shí)驗(yàn)室前期工作[13]，在蒸餾水中制備包含200 g/L葡萄糖和7 g/L酒石酸（pH 3.30）的合成基質(zhì)。為鑒定揮發(fā)性化合物，將每種標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙醇（色譜級(jí)），然后混合。將混合的標(biāo)準(zhǔn)溶液用合成基質(zhì)依次稀釋至10 級(jí)。每條校準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)均高于98%。另外，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室沒有的標(biāo)樣，以4-甲基-2-戊醇作為內(nèi)標(biāo)，利用總離子流峰面積定量其他化合物。

1.3.6 OAV計(jì)算

OAV按下式[14]計(jì)算：

式中：Ci為揮發(fā)性成分的含量/（μg/kg）；OTi為揮發(fā)性成分在參考文獻(xiàn)中的香氣閾值/（μg/kg）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 2018、Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行方差分析；采用MetaboAnalyst 2.0（http://www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行偏最小二乘判別分析、熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)測定結(jié)果

如圖2所示，在葡萄生長期中，pH值、可溶性固形物含量持續(xù)增多，總酸則不斷降低，而果實(shí)平均質(zhì)量在成熟期增多，后熟期則降低。葡萄漿果在最后階段經(jīng)歷了一系列的凍融循環(huán)，在此期間溫度降至0 ℃以下，細(xì)胞破裂是由一系列的凍融循環(huán)導(dǎo)致的，寒冷的環(huán)境有助于冰葡萄漿果成熟。

圖2 架式對(duì)理化指標(biāo)影響Fig. 2 Influence of different training systems on physicochemical indicators of grapes

pH值、總酸、可溶性固形物含量是評(píng)估葡萄成熟度的3 個(gè)重要指標(biāo)[13]。陳代等[15]證明了作物糖類物質(zhì)隨著光照延長其含量不斷累積，表明葡萄糖類物質(zhì)合成可受光照影響?？扇苄怨绦挝锖康娘@著增加與果實(shí)平均質(zhì)量后熟期的降低均是表明葡萄果實(shí)在生長的表現(xiàn)形式之一，可溶性固形物的富集與果實(shí)失水有關(guān)，而果實(shí)細(xì)胞失水是導(dǎo)致平均果粒質(zhì)量降低的原因之一。

葡萄成熟期高降水量以及葡萄果實(shí)有機(jī)酸的降解是導(dǎo)致pH值持續(xù)增高、酸度持續(xù)降低的重要原因。pH值低于5可能會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性化合物和漿果中的糖分積累[16-17]。 糖分的積累最終配合葡萄果實(shí)低溫的生長環(huán)境促進(jìn)高級(jí)醇類香氣化合物的形成[11]。

本實(shí)驗(yàn)測定的總酸趨于下降，保持穩(wěn)定，然后迅速增加；有些研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)有機(jī)酸含量隨果實(shí)成長發(fā)育而提高，在成熟后，有機(jī)酸含量反而降低[18]，這說明葡萄后熟期酸度趨于下降是葡萄成熟的體現(xiàn)。一些研究報(bào)告表明，在葡萄脫水期間，可滴定酸度降低可能是由于降解或酒石酸鉀結(jié)晶化引起的[11-19]。其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)壓榨汁液中可滴定的酸度由于失水的濃縮作用而增加[20]。

果實(shí)成熟期低pH值可一定程度防止病蟲害。而成熟期氣溫尚未到0 ℃以下，對(duì)葡萄漿果的呼吸作用有加強(qiáng)作用，致使呼吸代謝對(duì)酸的消耗增多，使總酸含量下降與pH值升高。隨著葡萄成熟，總糖不斷地積累是總固形物含量與果實(shí)平均質(zhì)量增加的重要原因。而在后熟期pH值與酸度趨于穩(wěn)定，但總可溶性固形物含量繼續(xù)增加、果實(shí)平均質(zhì)量開始減少可能是由于葡萄主干埋土后，經(jīng)過寒冷環(huán)境地不斷侵蝕，葡萄水分降低造成濃縮效果。

2.2 不同架式下采收期葡萄果實(shí)總香氣化合物含量與OAV貢獻(xiàn)率組成差異對(duì)比

由圖3A可知，采收期游離態(tài)威代爾葡萄果實(shí)香氣化合物含量由高級(jí)醇類、萜烯類、C6類化合物主要構(gòu)成（均高于15%）。而由圖3B可知，游離態(tài)果實(shí)香氣主要由高級(jí)醇類、萜烯類、C6類構(gòu)成（＞15%）。因此，醇類、萜烯類、C6類化合物在威代爾葡萄香氣成分中香氣總含量貢獻(xiàn)率高，對(duì)游離態(tài)威代爾葡萄香氣貢獻(xiàn)大。而C9類、降異戊二烯類化合物雖然OAV貢獻(xiàn)率未達(dá)到15%，但由圖3B清楚看出，這兩類物質(zhì)對(duì)采收期威代爾葡萄果實(shí)仍有一定作用。其原因在于此類香氣化合物含有大量高香氣閾值化合物，如C9類化合物中的反,反-2,4-壬二烯醛，其香氣閾值為0.09 μg/L[21]；降異戊二烯類化合物中的β-大馬士酮，其香氣閾值為0.05 μg/L[22]。其中β-大馬士酮同樣被報(bào)道對(duì)威代爾冰葡萄酒香氣具有重要貢獻(xiàn)[9]。

圖3 不同架式下采收期葡萄果實(shí)總香氣化合物含量（A）與 OAV（B）貢獻(xiàn)率組成差異對(duì)比Fig. 3 Influence of different training systems on aroma compound contents (A) and contribution rates to OAV (B) in grape berries

根據(jù)圖3A進(jìn)行架式對(duì)比可知，對(duì)于棚架，醇類、萜烯類由于1-庚醇、對(duì)傘花烴、4-松油醇含量增加，因此占比增加；C6類化合物占比最高的1-己醇，其含量增幅小于萜烯類化合物的含量增幅，占比率仍有所下降；對(duì)于籬架，醇類化合物占比增加是主要由于1-辛烯-3-醇含量的增加。萜烯類化合物占比減少主要因?yàn)閷?duì)傘花烴、 4-松油醇含量的大幅降低。而C6化合物含量占比基本保持不變。

由圖3B可看出，威代爾葡萄果實(shí)香氣主要由高級(jí)醇類、萜烯類、C6類、C9類香氣化合物組成（均大于15%），降異戊二烯類香氣物質(zhì)由于其極低的香氣閾值，如香氣閾值為0.09 μg/L的α-紫羅蘭酮[23]，被認(rèn)為是威代爾葡萄的典型性香氣種類之一。有研究報(bào)道葡萄發(fā)育過程中的主要甲氧基吡嗪為2-甲氧基-3-異丁基吡嗪[24]，同時(shí)吡嗪類化合物也參與植物中氣味的預(yù)警功能[25]。其中1-辛烯-3-醇、1-庚醇主要貢獻(xiàn)于高級(jí)醇類香氣；對(duì)傘花烴與反式-玫瑰氧化物主要貢獻(xiàn)萜烯類香氣；1-己醇、己醛主要貢獻(xiàn)C6類香氣；反,反-2,4-壬二烯醛主要貢獻(xiàn)C9類香氣。而β-大馬士酮?jiǎng)t是貢獻(xiàn)降異戊二烯類香氣的主要來源。有報(bào)道也得出結(jié)論C6類、萜烯類、降異戊二烯類物質(zhì)對(duì)于果香具有顯著的正向貢獻(xiàn)[26]。C6類化合物被報(bào)道為葡萄早期成熟的標(biāo)志，為葡萄酒提供了清新香氣[27]。

2.3 基于時(shí)間變化分析葡萄果實(shí)香氣化合物含量變化規(guī)律

萜烯、C6、高級(jí)醇類香氣化合物作為威代爾葡萄果實(shí)香氣總含量的主要組成種類，分析它們的香氣化合物含量變化對(duì)于探究葡萄香氣隨時(shí)間變化規(guī)律有指導(dǎo)意義。

已有報(bào)道表明，葡萄成熟過程中，果實(shí)香氣會(huì)進(jìn)行積累[28]。威代爾葡萄低溫環(huán)境下可進(jìn)入休眠狀態(tài)緩慢積累糖分，增強(qiáng)果實(shí)濃郁芳香的口感。由圖4可看出，威代爾葡萄果實(shí)香氣占比較大的C6類、高級(jí)醇類、萜烯類含量的變化規(guī)律總體呈現(xiàn)葡萄成熟期含量緩慢增長，葡萄后熟期含量增長加快的特點(diǎn)。其中根據(jù)C6、高級(jí)醇類化合物含量變化規(guī)律，葡萄果實(shí)香氣各采樣時(shí)間點(diǎn)除圖4A（花后120、180 d）與圖4C（花后160 d）外均不存在顯著差異，而從架式總體對(duì)比，籬架樣品僅在葡萄臨近采收期（花后170～180 d）香氣化合物含量略高于棚架。而根據(jù)萜烯類物質(zhì)含量變化規(guī)律，葡萄成熟期不存在顯著差異，而在葡萄后熟期籬架萜烯類總量顯著高于棚架。據(jù)推測，這很可能是因?yàn)橥鸂柶咸言诨ê?20 d進(jìn)行掛枝冷凍，進(jìn)入后熟階段開始，2016年溫度低于0 ℃的時(shí)間在花后140 d，環(huán)境溫度較快的降至0 ℃以下加長了掛枝后熟時(shí)間，促進(jìn)了葡萄果實(shí)后熟過程，促進(jìn)了香氣化合物的積累。

圖4 C6（A）、萜烯（B）、高級(jí)醇（C）類香氣化合物含量變化Fig. 4 Changes in C6 compounds (A), terpenes (B) and higher alcohols responsible for the aroma (C)

在果實(shí)中，經(jīng)過關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)生成相應(yīng)的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。威代爾典型性香氣主要在后熟期經(jīng)冷凍濃縮后表現(xiàn)出。而萜烯類則作為威代爾典型性香氣之一，在葡萄后熟期含量變化規(guī)律符合以上結(jié)論。Bowen等[11]指出在葡萄后熟期，果實(shí)會(huì)在高糖、低溫的環(huán)境下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，生成高級(jí)醇類香氣化合物，因此高級(jí)醇類含量后熟期急劇上升。在果實(shí)未成熟時(shí)，主要呈現(xiàn)為C6類化合物典型香氣特征生青味。而隨著葡萄進(jìn)入進(jìn)入后熟期，C6類香氣物質(zhì)很快由花香、葡萄香、青香主導(dǎo)的1-己醇占主導(dǎo)地位（采收期占比大于60%），葡萄果實(shí)后熟過程可能促進(jìn)了1-己醇的香氣物質(zhì)合成，含量提高的同時(shí)促進(jìn)總量提高，為威代爾葡萄總體香氣作出貢獻(xiàn)。

2.4 架式差異影響熱圖分析

對(duì)于不同架式威代爾葡萄香氣的分析探討，通常選用OAV判斷葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)對(duì)葡萄香氣特征的 貢獻(xiàn)[29]。一般研究認(rèn)為OAV大于1的香氣物質(zhì)對(duì)葡萄整體香氣有貢獻(xiàn)[30]，且OAV越大，對(duì)威代爾葡萄香氣的整體貢獻(xiàn)越高。本實(shí)驗(yàn)共測得游離態(tài)香氣種類共計(jì)87 種，其中經(jīng)查閱資料查找相關(guān)閾值并計(jì)算各香氣物質(zhì)的OAV以后，統(tǒng)計(jì)出的OAV大于1的香氣物質(zhì)達(dá)24 種，并經(jīng)過聚類分析作出熱圖。

由圖5可知，對(duì)葡萄整體香氣有貢獻(xiàn)的物質(zhì)變化規(guī)律分為3 類。第1類香氣物質(zhì)包括乙酸苯乙酯、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘、β-大馬士酮，整體含量呈逐漸降低的規(guī)律，尤其在葡萄成熟期下降速度尤為明顯。而且對(duì)于此類香物化合物含量籬架普遍高于棚架，可能是籬架透光性好，受光面積高于棚架，光合作用強(qiáng)，在成熟前期香氣化合物儲(chǔ)備含量高。第2類物質(zhì)包括己醛、里那醇，整體香氣化合物含量呈先升高后降低的規(guī)律，在花后120～140 d趨于峰值，同時(shí)己醛、里那醇籬架含量顯著高于棚架?？赡苁且?yàn)?016年降水量因華北氣旋的影響在120～140 d有一段強(qiáng)降水時(shí)間，葡萄植株茁壯生長，同時(shí)籬架相比于棚架葉受光面積更大，促進(jìn)葉片進(jìn)行光合作用。光合作用有利于有機(jī)物的合成，產(chǎn)生植物生長所需的有機(jī)物與干物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)了香氣物質(zhì)的積累。第3類物質(zhì)種類最多，其中與棚架關(guān)聯(lián)性更高的香氣物質(zhì)包括1-辛烯-3-醇、反式-2-辛烯醛、2-十一碳烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、3-辛烯-2-酮、反式-2-癸烯醛。與籬架關(guān)聯(lián)的香氣物質(zhì)比棚架種類多，包括順式-3-己烯醇、3-辛酮、順式-2-庚烯醛、1-己醇、橙花醇氧化物、3-辛醇、4-松油醇、2-異丁基-3-甲氧基吡嗪、對(duì)傘花烴、1-庚醇、苯乙醇、玫瑰氧化物、反式-玫瑰氧化物。香氣變化規(guī)律總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在花后130～140 d速增長并于花后170～180 d達(dá)到峰值。這也表明了威代爾冰葡萄進(jìn)入后熟期連體冷凍的方式可以極大促進(jìn)該類冰葡萄香氣物質(zhì)積累，尤其在花后140～160 d香氣積累急速加快，這可能與環(huán)境溫度開始低于0 ℃有關(guān)，0 ℃以下的氣溫可能更容易促進(jìn)冰葡萄特有香氣物質(zhì)合成。葡萄的冷凍過程使?jié){果經(jīng)歷了冷凍和解凍循環(huán)，導(dǎo)致葡萄漿果揮發(fā)性化合物產(chǎn)生進(jìn)而改進(jìn)冰酒釀造風(fēng)味[8]。

圖5 不同架式下葡萄香氣熱圖對(duì)比分析Fig. 5 Comparative analysis of heat maps of aroma compounds in grapes from different training systems

2.5 架式差異影響VIP得分圖與香氣雷達(dá)圖分析

對(duì)于采收期的威代爾葡萄果實(shí)樣品中不同架式下的各OAV進(jìn)行偏最小二乘判別分析，結(jié)果如圖6所示。由變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）可知棚架培育出的果實(shí)香氣與C9類、醛類、吡嗪類香氣物質(zhì)以及高級(jí)醇類香氣物質(zhì)中的1-辛烯-3-醇關(guān)聯(lián)性更高。而籬架培育出的果實(shí)香氣與降異戊二烯類、C6類、萜烯類、酯類，以及高級(jí)醇中的1-庚醇關(guān)聯(lián)性更高。

圖6 不同架式下葡萄香氣偏最小二乘判別分析（A）與 香氣雷達(dá)圖（B）分析Fig. 6 PLS-DA (A) and aroma radar chart (B) analysis of aroma compounds in grape from different training systems

參考吳玉文[31]研究，根據(jù)檢測出的各香氣化合物的香氣特征，將這些呈香物質(zhì)分為8 個(gè)香氣類型，即青草香、花香、果香、甜香、蜂蜜香、脂肪香、柑橘香、化學(xué)香，相似的香氣化合物的香氣特征OAV累加，得出威代爾葡萄果實(shí)各特征風(fēng)味的強(qiáng)弱描述。進(jìn)而得出威代爾葡萄果實(shí)的香氣雷達(dá)圖。由圖6B可知，青草香、花香、果香是威代爾葡萄果實(shí)最突出的香氣特征，在此3 種香氣類型中架式之間并不存在顯著性差異。青香、果香的最大貢獻(xiàn)者是籬架中含量更高的1-己醇，花香則為 反,反-2,4-壬二烯醛。而在柑橘香、脂肪香、甜香方面籬架顯著高于棚架，這與圖6A中的結(jié)論相互印證。

3 結(jié) 論

采收期游離態(tài)威代爾葡萄果實(shí)香氣經(jīng)過定性分析測得87 種香氣物質(zhì)，其中香氣化合物總含量主要由高級(jí)醇類、萜烯類、C6類香氣化合物構(gòu)成，且各自香氣化合物總含量變化規(guī)律均呈現(xiàn)隨時(shí)間延長含量不斷增加的趨勢(shì)，且在葡萄后熟期增長幅度尤為明顯；而果實(shí)香氣貢獻(xiàn)方面架式差異明顯：棚架主要由高級(jí)醇類、C6、C9類香氣化合物組成，而籬架主要由高級(jí)醇類、萜烯類、C6類香氣化合物組成，且萜烯類化合物含量占比最高。而根據(jù)OAV貢獻(xiàn)率組成可知，棚架香氣含量最高的是C9類化合物而籬架則是萜烯類化合物。熱圖分析得出1-辛烯-3-醇、反式-2-辛烯醛、2-十一碳烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、3-辛烯-2-酮、反式-2-癸烯醛以上6 種（OAV大于1）香氣化合物僅在葡萄后熟期呈現(xiàn)棚架香氣化合物含量高于籬架的規(guī)律，剩余18 種物質(zhì)均呈現(xiàn)籬架高于棚架的規(guī)律，在葡萄成熟期尤為明顯。通過對(duì)葡萄香氣數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析，并在此基礎(chǔ)上繪制香氣雷達(dá)圖，威代爾葡萄果實(shí)最突出的香氣特征在青草香、花香、果香方面籬架略優(yōu)于棚架；在柑橘香、脂肪香、甜香方面籬架顯著高于棚架。因此，籬架相比于棚架是更適合桓仁地區(qū)威代爾葡萄栽培的架式選擇。