金銀花中綠原酸的積累和生物合成研究進展

徐萍 ，徐小博，郭暉，許平輝，李鳳梅，TATIANA Fotina

1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）；2.新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司（新鄉(xiāng) 453300）；3.獸醫(yī)學(xué)院蘇梅國立農(nóng)業(yè)大學(xué)（蘇梅 40021）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicerae JaponicaeThunb）的干燥花蕾或帶初開的花，味甘，性寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效[1-2]。金銀花種植已有1000多年的歷史，以河南、山東為主產(chǎn)區(qū)，且河南產(chǎn)地的品質(zhì)佳[3]。金銀花中的標(biāo)志性成分是綠原酸和木犀草苷[1]。綠原酸（chlorogenic acid，CGA）屬于苯丙素類化合物[4]，其對生物體的生理作用主要表現(xiàn)在清除體內(nèi)活性氧自由基以及抗氧化作用[5]?；蛐?、產(chǎn)地、栽培管理方式等都會影響金銀花中綠原酸的含量。隨著新一代測序的發(fā)展，CGA的生物合成途徑研究越來越深入，這將有助于通過基因工程方法來提高內(nèi)源的綠原酸含量。

近年來對金銀花中綠源酸的生物合成研究取得了很多進展。綜述了近年影響金銀花中綠原酸含量的因素、綠原酸生物合成途徑及其調(diào)控方面的最新研究成果，以期為綠原酸的生物合成及調(diào)控研究提供理論參考。

1 金銀花中綠原酸的積累規(guī)律

1.1 產(chǎn)地對金銀花中綠原酸含量的影響

產(chǎn)地的自然環(huán)境對金銀花品質(zhì)的形成十分重要，不同產(chǎn)地金銀花的有效成分綠原酸、木犀草苷含量有明顯的差異[6]。張重義等[7]比較了不同產(chǎn)地中藥材金銀花的質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的地理環(huán)境，由于土壤、光照強度、光照時間等因素的影響造成綠原酸含量的差異。因此，強調(diào)藥材的道地性是有道理的。

1.2 基因型差異對金銀花中綠原酸含量的影響

目前栽種的金銀花優(yōu)良品種有“金豐一號”“九豐一號”“中金一號”“四季樹型”“北花1號”。栽培品種的綠原酸含量都能達(dá)到中華人民共和國藥典（2020）要求，但品種間存在差異。林慧彬等[8]對10個金銀花品種的質(zhì)量分析表明，金銀花種質(zhì)之間綠原酸含量差異明顯，10個金銀花種質(zhì)樣品綠原酸含量均符合藥典規(guī)定。綠原酸的含量在1.94%～4.00%之間，其中“亞特”良種金銀花、“亞特立本”金銀花、“山東平邑”金銀花及“九豐一號”金銀花綠原酸含量較高。

1.3 不同生長時期金銀花中綠原酸含量變化

采收期是影響金銀花中綠原酸、木犀草苷含量最重要的因素之一。不同采收期金銀花的綠原酸含量和產(chǎn)量存在差異[9-11]。李建軍等[12]研究表明金銀花不同花期綠原酸含量為0.350%～2.501%，二白期最高，其次為三青期和大白期，凋花期最低。莫愛瓊等[13]研究了華南忍冬不同發(fā)育階段花超微結(jié)構(gòu)及其綠原酸積累規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在花冠筒中，幼蕾期和綠蕾期綠原酸含量豐富；白蕾期薄壁細(xì)胞內(nèi)綠原酸含量開始減少，維管束仍積累較多的綠原酸；銀花期和金花期薄壁細(xì)胞綠原酸含量進一步減少且分散分布，維管束累積的綠原酸也減少，主要分布在木射線中。在花萼筒—子房中，不同發(fā)育階段，其薄壁細(xì)胞、維管束、中軸胎座和胚珠都有綠原酸分布。表明綠原酸可能在葉綠體內(nèi)合成，然后轉(zhuǎn)至細(xì)胞液中聚合，最后在液泡內(nèi)積累；葉綠體中淀粉粒數(shù)量與綠原酸合成呈負(fù)相關(guān)。

2 金銀花中綠原酸的生物合成途徑及相關(guān)酶

2.1 金銀花中綠原酸的生物合成途徑

綠原酸是植物中的葡萄糖經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的。葡萄糖經(jīng)過相關(guān)酶的催化轉(zhuǎn)化成莽草酸，再由莽草酸轉(zhuǎn)化成苯丙氨酸，在苯基丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）作用下生成肉桂酸，肉桂酸再在肉桂酸羥化酶作用下生成香豆酸，繼而在香豆酰輔酶連接酶（4-coumarate：coenzyme a ligase，4CL）作用下生成香豆酰輔酶A[14-15]。香豆酰輔酶A繼續(xù)生成綠原酸CGA的生途徑存在三個路線（圖1），目前仍存在爭論。已提出的三種生物合成途徑是：第一種途徑為由羥基肉桂酰-CoA奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（hydroxycinnamoyl CoA transferase，HQT）催化奎尼酸和咖啡酰CoA生成。第二種途徑表明CGA來自奎尼酸和咖啡酰-D-葡萄糖，并由羥基肉桂?；咸烟谴呋嚎鼘幩崃u基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）。第三種途徑提出CGA來自對香豆?？崴?，并由羥基肉桂酰CoA莽草酸/喹啉羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶催化[16-17]。

圖1 植物中綠原酸的生物合成途徑

2.2 綠原酸生物合成途徑的相關(guān)酶

2.2.1 苯丙氨酸酶（PAL）

PAL是苯丙烷類化合物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶。關(guān)鍵酶基因大都是以基因家族的形式存在，秦雙雙等[18]分別檢測了華南忍冬PAL1，PAL2，PAL3基因在花蕾和葉中的表達(dá)水平，PAL3在花蕾中的表達(dá)水平要高于葉，推測華南忍冬PAL3基因可能與綠原酸成分積累有關(guān)。但金銀花中的PAL基因的全長序列尚未見報道。

2.2.2 4-香豆酸-輔酶A連接酶（4CL）

最近，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，已在A.thaliana和Oryza sativa中表征了許多4CL。Yuan等[19-21]預(yù)測了LJ4CL1的功能，獲得了粗LJ4CL1蛋白，4-香豆酸是LJ4CL1的底物之一，并基于表達(dá)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和底物表征，提出LJ4CL功能與金銀花中綠原酸等化合物的合成有關(guān)。

2.2.3 香豆酸-3-羥化酶（C3H）

C3H是一種編碼香豆酸-3-羥化酶的基因，參與綠原酸生物合成的酶。Pu等[22]分離和鑒定LjC3H基因（登錄號：KC765076），序列全長為2114 bp，其中包含1533 bp的開放閱讀框，296 bp的5’非翻譯區(qū)，285 bp[包括18個核苷酸的poly（A）尾]和3’非翻譯區(qū)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該蛋白屬于CYP98A亞家族，同源模型顯示其結(jié)構(gòu)類似于其他細(xì)胞色素P450家族蛋白[23]。Southern印跡分析表明，在Lonicera japonica基因組中存在多于一個與LjC3H同源的序列。LjC3H cDNA在大腸桿菌中的異源表達(dá)體外測定試驗揭示該酶有利于對香豆?；Р菟嶙鳛榈孜锏膶ο愣辊；?。進一步研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯處理和暴露于UV-B輻射處理均能上調(diào)LjC3H的轉(zhuǎn)錄。金銀花葉片中的綠原酸含量水平與LjC3H轉(zhuǎn)錄本豐度呈正相關(guān)。隨后，亓希武等[24]克隆得到一個與LjC3H同源的基因，命名為LjC3H2（登錄號：KX845342）。該同源基因編碼框全長1521 bp，編碼506個氨基酸殘基，理論等電點為8.92，理論分子質(zhì)量為57.4 kDa。蔣向輝[25]將LjC3H的5’-RACE和3’-RACE擴增產(chǎn)物序列在Genedoc軟件中進行拼接，也得到一條LjC3H基因的全長序列（登錄號：JX272843）。

2.2.4 羥基肉桂酰-CoA莽草酸/喹啉羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）

莽草酸/奎寧酸香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）是金銀花中綠原酸合成途徑的關(guān)鍵酶。Liu等[26]首次在L.japonica中發(fā)現(xiàn)HCT基因。研究發(fā)現(xiàn)LjHCT1和Cynara cardunculusvar.scolymus是最相似的，相似度為83%。蔣向輝[25]將LjHCT的5’-RACE和3’-RACE擴增產(chǎn)物序列在Genedoc軟件中，拼接得到LjC3H1基因的全長序列（登錄號JX424844）。何柳等[27]通過cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)克隆獲得8條可能的HCT基因cDNA全長序列。其中1個基因為金銀花 HCT（LjHCT）基因，該基因全長1275 bp，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為47 kDa，進化關(guān)系表明LjHCT與咖啡（Coffea arabica）中HCT氨基酸序列相似度達(dá)到86%。

2.2.5 羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（HQT）

羥基肉桂酰輔酶A奎尼羥基肉桂轉(zhuǎn)移酶（HQT）是金銀花綠原酸合成過程中的另一個關(guān)鍵酶。Zhang等[28]通過利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得了用HQT轉(zhuǎn)化的金銀花愈傷組織，構(gòu)建HQT真核表達(dá)載體，證實了HQT基因表達(dá)可以調(diào)控金銀花中綠原酸的含量。Peng等[17]從L.japonica中分離出編碼439個氨基酸的蛋白質(zhì)的羥基肉桂酰-CoA奎寧羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HQT）基因（登錄號：GQ847546），RT-PCR結(jié)果顯示HQT的組織分布與CGA含量的模式一致。駱鷹等[29]對金銀花HQT基因（Lonicera japonicaAIG20957.1）氨基酸序列與其他植物間相應(yīng)片段進行同源比對和系統(tǒng)進化分析，并對該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等方面進行了預(yù)測和分析。LjHQT編碼的蛋白含424個氨基酸，是一種親水性蛋白，LjHQT可能定位于葉綠體或其他細(xì)胞器；其編碼的氨基酸序列與中果咖啡（Coffea canephora）的同源關(guān)系較近。張靜茹等[30]進一步研究發(fā)現(xiàn)，金銀花愈傷組織中綠原酸的量隨HQT基因表達(dá)量的升高而升高，說明其對綠原酸的生物合成有調(diào)控作用。在忍冬科其他植物中也證明HQT基因與綠原酸產(chǎn)量密切相關(guān)[31]，陳澤雄[32]從灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz）中克隆出了Lm HQT1基因。

3 綠原酸生物合成途徑的調(diào)節(jié)

3.1 金銀花中的轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）是重要的DNA結(jié)合蛋白。TF影響RNA聚合酶對基因啟動子的接近，并通過與轉(zhuǎn)錄機制的其他組分相互作用在基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。目前在金銀花中調(diào)控綠原酸生物合成的轉(zhuǎn)錄因子有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，b ZIP）蛋白和MYB轉(zhuǎn)錄因子。

3.1.1 堿性亮氨酸拉鏈（b ZIP）蛋白

堿性亮氨酸拉鏈蛋白是真核生物的轉(zhuǎn)錄因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的類型之一，因其含有b ZIP結(jié)構(gòu)域而命名。b ZIP結(jié)構(gòu)域由60～80個氨基酸組成，包含一個基礎(chǔ)區(qū)域和一個亮氨酸拉鏈。近年來，越來越多的b ZIP轉(zhuǎn)錄因子功能被揭示，研究發(fā)現(xiàn)其參與植物多個中心調(diào)控和生理過程。Zha等[33]首次研究了金銀花中b ZIP家族的功能和表達(dá)，分別從金銀花（Lonicera japonica）和紅白忍冬（Lonicera japonicavar.chinensis）中獲得11個LjbZIP 蛋白和24個rLjbZIP蛋白，均含有b ZIP保守域，11個LjbZIP的序列登錄號為KT218625-KT218635。進一步研究發(fā)現(xiàn)只有LjbZIP8可以特異性地結(jié)合到LjPAL2啟動的 G-box上，亞細(xì)胞定位和電泳遷移率變動分析顯示轉(zhuǎn)錄因子LjbZIP8是核定位蛋白。生物信息學(xué)分析揭示 LjbZIP8包含432 bp編碼144氨基酸的ORF區(qū)，預(yù)測的保守結(jié)構(gòu)域顯示LjbZIP8屬于具有N末端富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域的bZIP GBF1亞家族。

3.1.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，其中一些MYB家族成員可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來調(diào)控植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)，與花相比，葉中的MYB家族的ein3和gbf1上調(diào)，nap下調(diào)。Ein3及其最接近的同系物eil1是ein2下游的兩個主要轉(zhuǎn)錄因子，對誘導(dǎo)多個乙烯反應(yīng)基因具有非常重要作用[35]。Zhang等[34]研究分析顯示ein3與eil1和ap2相互作用。eil1和ap2都與乙烯介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)聯(lián)。由此推斷ein3，eil1和ap2可能形成復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，以調(diào)節(jié)金銀花葉片衰老過程。此外還發(fā)現(xiàn)ein3在花中下調(diào)，表明在L.japonica的花衰老調(diào)控過程中存在不同的信號途徑。同時花中的綠原酸含量高于葉中的，這與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)一致，暗示MYB轉(zhuǎn)錄因子對綠原酸合成調(diào)控具有重要意義。Zhang等[34]通過進一步的研究還發(fā)現(xiàn)了金銀花中的其他MYB轉(zhuǎn)錄因子，如C2H2和ERF等。Qi等[36]從金銀花中分離了R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因LjaMYB12，在擬南芥中異位表達(dá)LjaMYB12可以增加PAL活性，表明LjaMYB12具有調(diào)節(jié)綠源酸生物合成的可能。在茄科作物中研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB11、AtMYB12轉(zhuǎn)入植物體后，多酚類物質(zhì)合成途徑與多個相關(guān)合成基因的上調(diào)表達(dá)有關(guān)，綠原酸的含量也增加[37]。

3.2 DNA甲基化對綠原酸生物合成的影響

Zha等[33]研究發(fā)現(xiàn)用5-氮雜胞苷處理降低了金銀花葉片中LjPAL2的轉(zhuǎn)錄水平和CGA的含量。DNA甲基化可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子LjbZIP的募集，從而調(diào)節(jié)L.japonica中PAL2表達(dá)水平和CGA含量。植物堿性亮氨酸拉鏈蛋白在高等植物基因表達(dá)與調(diào)控中起重要作用。

3.3 其他因素對綠原酸生物合成的影響

研究發(fā)現(xiàn)外源物質(zhì)、內(nèi)生菌和植物病害也會影響綠原酸生物合成途徑。朱艷霞等[38]通過噴施GA3能夠顯著提高金銀花內(nèi)源激素GA3水平，顯著提高C4H1，C4H2，4CL1，HQT2基因表達(dá)量，顯著提高活性成分綠原酸和咖啡酸的含量。周蕓帆等[39]發(fā)現(xiàn)忍冬枝枯病可以通過影響苯丙素生物合成途徑中桂皮酸途徑相關(guān)酶基因Lj HQT和Lj C4H2的轉(zhuǎn)錄水平來影響金銀花中綠原酸的合成。唐明[40]研究表明，6種內(nèi)生菌均不同程度地影響著‘渝蕾1號’懸浮體系生物量的含量和綠原酸的積累。

4 結(jié)語與展望

盡管在金銀花中綠原酸的積累特點和生物合成途徑方面的研究逐漸增多，但仍存在以下問題：（1）金銀花中綠原酸的積累規(guī)律還不完全明確；（2）金銀花中綠原酸生物合成途徑需要進一步明確闡明，綠原酸在組織中的定位及運輸仍需深入研究；（3）需要加強綠原酸生物合成途徑調(diào)控研究，例如研究轉(zhuǎn)錄因子對該途徑的調(diào)控，揭示綠原酸生物合成的調(diào)控機制有助發(fā)現(xiàn)高效提高綠原酸含量的方法；（4）通過組織工程的方法生產(chǎn)綠原酸的研究還很少，如何通過生物本身或者異源表達(dá)宿主的代謝工程來提高綠原酸產(chǎn)量，需要開展相關(guān)研究。