多肉植物紅寶石組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

陳偉 曾凡 趙光輝

摘 要：為建立多肉植物紅寶石高效組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)保障。以多肉植物紅寶石的幼嫩葉片作為外植體，進(jìn)行多肉植物紅寶石組培快繁技術(shù)研究。結(jié)果表明：采用75%酒精浸泡60 s，再使用0.1%升汞處理10 min是紅寶石外植體最佳消毒處理方法。紅寶石愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1（pH=6.0），誘導(dǎo)率可達(dá)83.3%;愈傷組織分化成芽的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1（pH=6.0），分化率可達(dá)77.78%;生根最適培養(yǎng)基為1/2 MS+活性炭2.0 g·L1（pH=6.0），生根率可達(dá)70.00%。

關(guān)鍵詞：多肉植物;紅寶石;組織培養(yǎng);快繁技術(shù)

中圖分類號：S 682.33?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）08-0033-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.08.005

Rapid Propagation of Sedeveria Pink Ruby by Tissue Culture

CHEN Wei， ZENG Fan， ZHAO Guang-hui

（Fuzhou Institute of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350018， China）

Abstract： In order to establish the rapid propagation technology system of Sedeveria pink ruby by high-efficient tissue culture， and provide the technical support for industrialized production， the tissue culture and rapid propagation technology of Sedeveria pink ruby was studied by using the young leaves of Sedeveria pink ruby as the explants. The results showed that 75% alcohol soaked for 60 s and 0.1% mercury bichloride treated for 10 min were the best disinfection treatments for the explants of Sedeveria pink ruby. The optimal culture medium for callus induction of Sedeveria pink ruby was MS+1.5 mg·L1 6-BA+0.5 mg·L1 NAA （pH=6.0）， with the induction rate of 83.3%. The optimum culture medium for bud differentiation from callus was MS+0.6 mg·L1 6

-BA+0.2 mg·L1 NAA （pH=6.0）， with the differentiation rate of 77.78%. The optimal culture medium for rooting was 1/2 MS+2.0 g·L1 activated carbon （pH=6.0）， and the rooting rate could reach 70.00%.

Key words： Succulents; Sedeveria pink ruby; Tissue culture; Rapid propagation technology

多肉植物紅寶石Sedeveria pink ruby為景天科擬石蓮花屬植物，是近幾年發(fā)展較快的一種多肉植物[1]。紅寶石是中小型多肉品種，非常容易群生，長成爆盆品種;其葉片較多，光滑，細(xì)長匙狀，前端較肥厚、斜尖，呈蓮花狀緊密排列，整體較包裹，植株緊湊，單株直徑5 cm左右。紅寶石正常生長時(shí)顏色為綠色，如溫差大、光照充足，其顏色會從綠色變成火紅色，色澤如寶石，加上其容易群生，長成捧花狀態(tài)，具有較高的觀賞價(jià)值。但紅寶石生產(chǎn)主要以葉插繁殖為主，因其繁殖速度慢、生產(chǎn)周期長、加上病毒不斷積累，品質(zhì)受到較大的影響。

植物組織培養(yǎng)是利用植物細(xì)胞能夠發(fā)育成完整植株的功能進(jìn)行的無性繁殖方法，組織培養(yǎng)能保持原有品種固有的性狀和特性，可以用來解決制約多肉植物產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的繁殖問題[2-6]。目前已有景天屬景天科大和錦、勞爾、石臺景天、大花紅景天、青鎖龍、八寶景天、黃麗等多肉植物組織培養(yǎng)的研究[7-13]，但是利用紅寶石葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究未見報(bào)道。因此，開展紅寶石組織培養(yǎng)技術(shù)研究在生產(chǎn)顯得尤為重要。本研究通過對多肉植物紅寶石組織培養(yǎng)過程中的外植體消毒方式、培養(yǎng)基激素配比進(jìn)行研究，篩選紅寶石叢生芽誘導(dǎo)、增殖、生根繁殖等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的最適培養(yǎng)條件，探索多肉植物紅寶石組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，以期為多肉植物紅寶石的工廠化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以多肉植物紅寶石幼嫩葉片為外植體，材料來源于福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所多肉種植示范大棚。夏季紅寶石為休眠期不適取材，此季節(jié)的多肉植物外植體在培養(yǎng)基中對激素常反應(yīng)遲鈍，生長靜止，不易培養(yǎng)成功。

1.2 試驗(yàn)藥劑及儀器

MS培養(yǎng)基母液、鹽酸、氫氧化鈉、蔗糖、瓊脂粉（凝膠強(qiáng)度>1300 g·cm2）、6-糠基氨基嘌呤（KT）、萘乙酸（NAA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、75%酒精、升汞溶液0.1%。1 mL移液槍、5mL移液槍、解剖刀、鑷子、酒精燈、濾紙、濾紙盒、國之源P20-y超純水、培養(yǎng)瓶、陶瓷杯、YXQ-LS-74SII高壓滅菌鍋、無菌工作臺、1 L容量瓶、100 mL容量瓶、計(jì)時(shí)器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理 將紅寶石葉片以自來水沖洗干凈，用紗布將葉片包住，蒸餾水沖洗10 min，調(diào)整位置保證沖洗均勻。沖洗完后，取適量的表面洗滌劑（洗衣粉或洗潔精）放入 1000 mL 燒杯中，加蒸餾水用玻璃棒攪拌混勻，混勻后將紗布中的葉片輕放入燒杯。玻璃棒攪拌后，靜置10 min 充分去污。 取出紅寶石葉片，用紗布清洗葉片表面，清洗的過程中一定要全面，細(xì)細(xì)輕柔搓洗，洗凈之后再用蒸餾水沖洗葉片10 min。

1.3.2 無菌室及超凈臺滅菌 先對無菌室進(jìn)行滅菌，然后用酒精棉球擦拭超凈臺，打開超凈臺紫外線燈殺菌消毒20 min，打開排氣扇，防止細(xì)菌進(jìn)入，保持一個無菌的環(huán)境。

1.3.3 培養(yǎng)條件 在MS基本培養(yǎng)基上添加8 g·L1的瓊脂和30 g·L1的蔗糖，pH 值調(diào)節(jié)至 5.8～6.0，當(dāng)壓力達(dá)1.1 kg·cm

-2，121℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min，常溫后添加激素（激素已抽濾滅菌）備用。培養(yǎng)室溫度控制在25℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光周期為12 h·d1的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.3.4 外植體的消毒 外植體的消毒方法選擇先用75%酒精浸泡，再用0.1%升汞浸泡處理，處理時(shí)間分別為3、5、10 min。將處理好的紅寶石葉片在自來水下沖洗干凈之后放入超凈工作臺內(nèi)，先用75%酒精浸泡60 s，要輕微振蕩，切勿搖出;再用0.1%升汞分別浸泡處理3、5、10 min，而后用無菌水沖洗6遍，每遍10 s左右 ，沖洗之后用消毒濾紙吸干水分。將清洗消毒后的紅寶石葉片，橫切成0.3 cm左右的方塊，分別接種于預(yù)先滅菌的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個處理接種30個外植體。30 d后觀察其生長情況，并統(tǒng)計(jì)污染率。計(jì)算公式：污染率=污染數(shù)/30×100%。

1.3.5 誘導(dǎo)培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同濃度和配比的細(xì)胞分裂素6-BA、KT和生長素NAA，以紅寶石葉片作為外植體接種到6種不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，處理1：MS+6-BA 2.0 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1;處理2：MS+6-BA 2.0 mg·L1+NAA 1.0 mg·L1;處理3：MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5? mg·L1;處理4：MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 1.0 mg·L1;處理5：MS+6-BA 1.0 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1+KT 0.5 mg·L1;處理6：MS+6-BA 1.0 mg·L1+NAA 2.0 mg·L1;每個處理接種6瓶，每瓶接種4個外植體，3次生物學(xué)重復(fù)，30～40 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況。計(jì)算公式：誘導(dǎo)率=形成愈傷組織或分化生根或成芽的個數(shù)/總接種數(shù)×100%。

1.3.6 分化培養(yǎng) 在超凈工作臺上將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)得到的40 d的愈傷組織接種于6種附加不同含量 6-BA、NAA、KT、IAA的分化培養(yǎng)基中，處理1：MS+KT 2.0 mg·L1+ IAA 2.0 mg·L1; 處理2：MS+KT 2.0 mg·L1+IAA 4.0 mg·L1;處理3：MS+ 6-BA 3.0 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1;處理4：MS+6-BA 1.0 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1; 處理5：1/2MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1;處理6：MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1;每組6瓶，每瓶接種4塊愈傷組織或叢生芽。分別于分化培養(yǎng)25、40 d后統(tǒng)計(jì)分化培養(yǎng)情況，并計(jì)算分化率，計(jì)算公式為：分化率=已分化的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.3.7 增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)得到的長勢良好的叢生芽或愈傷組織轉(zhuǎn)接至激素濃度為MS+L 6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，總共接種30 瓶，每瓶接種4塊叢生芽，分別于增殖培養(yǎng)30 d和40 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況。計(jì)算公式：增殖系數(shù)=出芽數(shù)/原有芽數(shù)。

1.3.8 生根培養(yǎng) 在無菌條件下，將增殖后的叢生芽分離出單芽，接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加不同濃度的 NAA，同時(shí)添加2.0 g·L1活性炭。生根培養(yǎng)基設(shè)處理1：1/2MS+活性炭2.0 g·L1;處理2：1/2MS+NAA 0.2 mg·L1+活性炭2.0 g·L1 ;處理3：1/2MS+NAA 0.03 mg·L1+活性炭2.0 g·L1。分別于生根培養(yǎng)30 d和40 d后統(tǒng)計(jì)組培苗的成長情況。

1.3.9 煉苗與移栽 小苗根長1 cm 時(shí)可以出苗，將培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，置于常溫室中自然散射光培養(yǎng)1周后，打開瓶蓋，煉苗2～3 d，鑷子取出瓶苗，用自來水洗凈根系附著的培養(yǎng)基，自然晾干水分后，種植于專門的基質(zhì)中。以泥炭、蛭石、珍珠巖復(fù)配材料為煉苗基質(zhì)，按照3∶1∶1 比例混勻。稍遮陰，并注意通風(fēng)，栽下后第1次不澆水。1個星期后噴1000倍多菌靈殺菌劑，澆少量水。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌條件篩選

從紅寶石外植體采用不同消毒方式的污染情況（表1）可知，紅寶石外植體先采用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%升汞浸泡處理10 min消毒的效果最佳，其污染率最低，僅為6.67%。

2.2 不同激素配比對紅寶石愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同激素配比的培養(yǎng)基均能成功誘導(dǎo)紅寶石形成愈傷組織，都有一定的誘導(dǎo)效果;誘導(dǎo)率最高可達(dá)83.3%，最低為25.5%（表2）。處理1、2、4、5、6中所有外植體均出現(xiàn)膨大、形成少量愈傷組織，但顏色不深，具有一定的誘導(dǎo)效果;在處理3中外植體均膨大、形成大量蓬松且顏色較深的愈傷組織，誘導(dǎo)作用較為明顯，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密（圖1）。適宜誘導(dǎo)紅寶石形成愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1。

2.3 不同激素配比對紅寶石愈傷組織分化的影響

從添加不同激素配比培養(yǎng)基對紅寶石愈傷組織分化的影響結(jié)果（表3）可知，MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1或1/2 MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA

0.2 mg·L1培養(yǎng)基中均可促進(jìn)紅寶石愈傷組織分化。其中，紅寶石在MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1的分化效果最好，25、40 d的分化率可達(dá)66.67%和77.78%。未添加6-BA或添加6-BA濃度超過1.0 mg·L1的培養(yǎng)基均不利于紅寶石愈傷組織分化，大部分愈傷組織分化培養(yǎng)之后褐化死亡。只有當(dāng)6-BA濃度在0.6 mg·L1時(shí)愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，呈淡黃綠色，叢生芽數(shù)量多，整齊度高（圖2）。研究結(jié)果表明適宜誘導(dǎo)紅寶石叢生芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1。

2.4 紅寶石愈傷組織增殖培養(yǎng)

將培養(yǎng)30 d，且長勢良好的愈傷組織或叢生芽轉(zhuǎn)接至MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，30 d后不定芽生長迅速，填充整個培養(yǎng)瓶（圖3）。大部分叢生芽的基部均可連續(xù)分化出幾個單芽，經(jīng)過40 d之后，可呈現(xiàn)出團(tuán)簇狀叢生，叢生芽逐漸變?yōu)樯罹G色。接種數(shù)為120個，增殖數(shù)517個，增殖系數(shù)為4.31。

圖3 紅寶石叢生芽繼代培養(yǎng)30 d生長情況

Fig.3 Growth of the cluster buds of Sedeveria pink ruby after the subculture for 30 days

2.5 不同培養(yǎng)基配比對紅寶石叢生芽生根的影響

從表4可知，處理1培養(yǎng)基中的芽生根率最高，30 d生根率為50%，40 d為70%，且生根粗壯，長度達(dá)1 cm（圖4）。結(jié)果表明：1/2MS+活性炭 2.0g·L1 的培養(yǎng)條件最為適宜，生根數(shù)量最多，效果好。

2.6 移栽

小苗根長1 cm 時(shí)可以出苗，取出瓶苗，用自來水洗凈根系附著的培養(yǎng)基，自然晾干水分后，種植于專門的基質(zhì)中，稍遮陰，并注意通風(fēng)。第1次不澆水。1個星期后噴殺菌劑，澆少量水。小苗移栽成活率可達(dá)78%。

3 討論與結(jié)論

多肉植物葉插繁殖速度慢，而利用組培快繁技術(shù)能夠快速獲得大量組培苗。由于多肉植物肉質(zhì)多汁，其外植體需消毒徹底，否則污染率較高。研究表明，多肉植物在組織培養(yǎng)過程中外植體消毒時(shí)間太長會出現(xiàn)葉片透明、白化現(xiàn)象，而消毒時(shí)間太短則外植體易受污染[14-15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明先用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%升汞處理10 min，是紅寶石外植體的最佳消毒方式，能獲得較低污染率的紅寶石無菌葉片。

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響組織培養(yǎng)器官分化的關(guān)鍵因素[16]，培養(yǎng)基中不同生長調(diào)節(jié)劑的相對濃度決定形成器官的類型。在含有細(xì)胞分裂素（如6-BA）的培養(yǎng)基中添加一定濃度的生長素（如NAA）能促進(jìn)不定芽的形成。植株組培中影響生根的因素，主要是培養(yǎng)基成分和激素成分與比例[17-18]。因此，探索最適激素濃度配比對紅寶石多肉植物快速繁殖具有重要意義。本研究通過對紅寶石各階段培養(yǎng)基配方進(jìn)行對比試驗(yàn)，確定紅寶石愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根階段的最佳培養(yǎng)基配方，試驗(yàn)結(jié)果表明紅寶石葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂粉+6-BA 1.5 mg·L1+ NAA 0.5 mg·L1（pH=6.0），誘導(dǎo)率為83.3%;愈傷組織分化成芽的最適培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂粉+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1（pH=6.0），分化率為77.78%;生根的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂粉+2.0 g·L1活性炭（pH=6.0），生根率為70.00%。本研究以多肉植體紅寶石葉片為外植體，篩選獲得了紅寶石葉片外植體的最佳消毒方式以及組織培養(yǎng)各階段的最佳培養(yǎng)基配方，初步建立紅寶石多肉植物組培快繁技術(shù)體系，研究結(jié)果可多肉植物紅寶石的工廠化育苗提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）

收稿日期：2021-03-24

作者簡介：陳偉，男，1968年生，副研究員，主要從事多肉植物研究。

基金項(xiàng)目：福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019-N-8）。