纖維素降解菌株的分離與篩選*

賴國棟 秦長生 趙丹陽 邱華龍 楊 華 田龍艷 練 濤 徐金柱

（廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

纖維素是地球上含量多、分布廣的可再生資源，其以木質(zhì)纖維形式存在，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成[1]，其主要來源于高等植物[2]。纖維素以其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)在自然界難以被降解[3]。目前纖維素的降解主要有物理法、化學(xué)法和生物法3 種方法，生物法相比其它兩種方法，具有安全性高、能耗低、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)勢[4]，逐漸被人們重視。生物法降解纖維素，主要依靠纖維素酶，自從1906 年Seilliere 首次在蝸牛腸胃消化液中發(fā)現(xiàn)的纖維素酶能降解纖維素以來[5]，纖維素酶就引起了國內(nèi)外研究人員重視。

纖維素酶的來源相當(dāng)廣泛，但目前仍然以產(chǎn)酶微生物為主，自1912 年P(guān)ringsheim 等人成功從土壤中篩選出第一批纖維素降解菌以來[6]，至今已從不同環(huán)境中分離獲得超過200 種可以產(chǎn)纖維素酶的微生物，其中不乏具有耐低溫、耐高溫、耐堿等特殊功能的微生物[7-10]。纖維素降解菌主要有真菌、細(xì)菌和放線菌，真菌產(chǎn)纖維素酶多為胞外酶，細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶多為胞內(nèi)酶，放線菌因產(chǎn)酶量低于真菌和細(xì)菌研究相對較少[11-12]。在我國綠化垃圾種類繁多，其主要成分以木質(zhì)纖維素為主[13-19]，但我國對纖維素的利用水平相對較低，本研究旨在篩選出能高效生產(chǎn)纖維素酶的菌株并鑒定，為提高我國纖維素利用率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣及菌株來源

土樣采自廣東省林業(yè)科學(xué)研究院枯枝落葉堆腐的土壤；菌株：木腐菌7 株，保存于廣東省林業(yè)科學(xué)研究院。

1.2 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMCNa）15 g，硝酸銨（NH4NO3）1 g，酵母膏1 g，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）1 g，蒸餾水1 000 mL。

（2）篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMCNa）20 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）2 g，七水硫酸 鎂（MgSO4·7H2O）0.3 g，硫 酸 銨(NH4)2SO41.4 g，氯化鈣（CaCl2）0.3 g，氯化鋅（ZnCl2）0.001 7 g，硫酸錳（MnSO4）0.001 6 g，氯化鈷（CoCl2）0.002 g，硫酸亞鐵（FeSO4）0.000 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0～7.2。

（3）發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨3 g，硫酸銨2 g，酵母膏0.5 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）4 g，氯化鈣（CaCl2）0.3 g，七水硫酸鎂（Mg-SO4·7H2O）0.3 g，Tween-80 0.2 mL，羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）20 g，蒸餾水1 000 mL。

（4）SDY 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖40 g，蒸餾水1 000 mL。

（5）LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉（NaCl）10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 主要試劑

（1）1 mg/mL 剛果紅溶液：稱取0.5 g 剛果紅，加蒸餾水溶解并定容至500 mL，室溫、避光保存。

（2）1 mol/L 氯化鈉溶液：稱取58.5 g NaCl,加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

（3）1.0 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱取烘干至恒重的葡萄糖0.10 g，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，4 ℃保存。

（4）檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH4.5）：A 液：稱取檸檬酸10.507 g 用蒸餾水溶解后定容至500 mL；B 液：稱取檸檬酸三鈉14.705 g 用蒸餾水溶解后定容至500 mL；取230 mL A 液和270 mL B 液混合后即為檸檬酸緩沖液。

（5）DNS 試劑：稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸（C7H4N2O7），21 g 氫氧化鈉（NaOH），182 g 酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O），5 g 苯酚（C6H5OH）（在50 ℃水溶化），5 g 偏重亞硫酸鈉（NaS2O5），攪拌至完全溶解，定容至1 000 mL,避光儲存于棕色試劑瓶中，4 ℃保存，放置一周后使用。

（6）1% CMC-Na：稱取1.0 g CMC-Na 溶解于100 mL 檸檬酸緩沖液中，4 ℃保存。

（7）DNA 提取試劑盒：M5 Fungal Genomic DNA Kit（50T）。

（8）菌株保存液：30%甘油與無菌水1:1 混合。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺、水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、攪拌器、高壓滅菌鍋、PCR 儀、pH 計(jì)、離心機(jī)、振蕩器、電子天平、恒溫振蕩培養(yǎng)箱等。

1.5 富集培養(yǎng)

將采集的土壤過篩處理，稱取土樣10 g，放入裝有100 mL 富集培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，加入3 顆無菌玻璃珠，30 ℃，150 rpm 振蕩培養(yǎng)3～4 d[9-10]。

1.6 菌株分離

取1 mL 富集培養(yǎng)液，梯度稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6共6 個(gè)梯度濃度，每個(gè)梯度各取0.1 mL，涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)，每個(gè)濃度涂布10 塊板。待菌落長出后，挑選不同形態(tài)的菌株劃線，獲得單菌株，純化菌株[9-10]。

1.7 纖維素降解能力測定初篩（剛果紅染色法）

分別將純化得到的菌株和實(shí)驗(yàn)室保存的7 株木腐菌點(diǎn)接到篩選培養(yǎng)基平板中央，每菌株3 個(gè)重復(fù)，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～6 d，根據(jù)菌落生長速度確定染色時(shí)間（菌落直徑不超過培養(yǎng)皿半徑前進(jìn)行染色）。取1 mg/mL 剛果紅溶液3 mL，均勻布于平板，染色30 min，用1 mol/L 氯化鈉溶液沖洗30～60 min，利用十字交叉法測量菌落直徑d（mm）和菌落外圍透明圈直徑D（mm），根據(jù)Hc值（Hc=D/d），確定供試菌株分解纖維素能力，篩選比值較大的菌株，進(jìn)行酶活測試[9-10]。

1.8 CMC 酶活測定復(fù)篩（DNS 法）

1.8.1 粗酶液的制備 將初篩目標(biāo)菌株接種至種子培養(yǎng)基（SDY 培養(yǎng)基），28 ℃，180 rpm 培養(yǎng)3 d，按10%接種量接種至裝有100 mL 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶中，每株菌設(shè)3 個(gè)重復(fù)，28 ℃，180 rpm培養(yǎng)5 d，取10 mL 發(fā)酵液，4 ℃，5 000 rpm 離心10 min，所得上清液即為粗酶液[9-10]。1.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一系列25 mL 具刻度試管并進(jìn)行標(biāo)號，根據(jù)表1 內(nèi)容依次加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和DNS 溶液?；靹蚝螅兴?0 min，迅速冷卻加蒸餾水定容至 25 mL，在540 nm 波長下，以1 號管調(diào)零測量各管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table 1 Draw a standard curve of glucose

1.8.3 纖維素酶（CMCase）活力測定 取4 支25 mL試管，設(shè)置1 個(gè)空白對照管和3 個(gè)試驗(yàn)管分別加入1 mL 粗酶液，將空白對照管進(jìn)行沸水滅活10 min，試驗(yàn)管不作沸水滅活處理。然后4 支試管均加入1.5 mL 1% CMC-Na，混勻，50 ℃保溫30 min 后沸水浴滅活10 min。再分別加入3 mL DNS 溶液沸水浴反應(yīng)10 min 后迅速冷卻，加蒸餾水定容至25 mL，于540 nm 波長下，以空白對照管調(diào)零，測定試驗(yàn)管的OD 值，并計(jì)算酶活力。

酶活力定義：在50 ℃條件下，1 mL 粗酶液1 min 產(chǎn)生1 μg 葡萄糖為一個(gè)酶活單位，用U/mL表示。酶活計(jì)算公式如下：

酶活力E=1 000×S×N/(T×V)

其中，E： 樣品的酶活力( U/mL) ；S：由樣品的平均吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上相對應(yīng)的葡萄糖含量(mg) ；N：粗酶液的稀釋倍數(shù)；1 000：mg 與 μg之間的換算倍數(shù)；T： 反應(yīng)時(shí)間( min) ；V： 參與反應(yīng)的粗酶液體積( mL)[9-10]。

1.9 高產(chǎn)酶菌株的鑒定

采用M5 Fungal Genomic DNA Kit（50T）試劑盒提取供試菌株總DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò) 增 分 析。以ITS1/ITS4 和ITS4/ITS86 為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（表2）。擴(kuò)增體系為25 μL（Premix Taq 12.5 μL，DNA 模 板2 μL，引 物0.5 μL，ddH2O 15 μL）。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)32次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。細(xì)菌以27F/1492R和357F/907R 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸90 s/30 s，循環(huán)32 次；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序。測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行同源性比較和聚類分析，確定菌株種類[9-10]。

表2 高產(chǎn)酶菌株鑒定所用引物Table 2 Primers for strain identification

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

從同一批次土壤中挑選1～2 株培養(yǎng)性狀（菌落形態(tài)、生長速率、色素分泌等）差異顯著的菌株進(jìn)行分離純化。經(jīng)富集培養(yǎng)分離，從3 批腐殖質(zhì)土壤中共分離獲得47 個(gè)菌株（表3）。

表3 土壤微生物形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of soil microorganisms

2.2 纖維素降解性能測試初篩

采用剛果紅染色法對土壤中分離的47 株菌和實(shí)驗(yàn)室保存的7 株木腐菌進(jìn)行纖維素降解能力測試。結(jié)果表明：供試菌株對纖維素鈉的降解能力存在明顯差異（Hc = 0-3.87），根據(jù)Hc 的大小，最終將供試菌株分為高產(chǎn)酶、低產(chǎn)酶、不產(chǎn)酶3 類。再次利用剛果紅染色，篩選出Y2、Y5、Y6 和 HF-3 共4 個(gè)菌株菌落外圍形成較大透明圈，Y5 的Hc 值最大，為3.87；Y2 的次之，Hc 值為2.54；Y6 的Hc 值1.86；HF-3 的生長速率最快，Hc = 1.35。初步篩選出Y2、Y5、Y6 和 HF-3 高產(chǎn)纖維素酶的菌株共4 株（圖1、表4）。

表4 高產(chǎn)纖維素酶菌株的Hc 值Table 4 Hc value of high cellulase producing strain

圖1 高產(chǎn)纖維素酶的菌株剛果紅染色結(jié)果Fig. 1 Congo red staining results of high cellulase producing strain

2.3 纖維素降解菌株酶活測定復(fù)篩

試驗(yàn)以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，OD 值540 nm的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示，線性回歸方程為：y=0.902 1x+ 0.090 4（R2=0.958 5），擬合效果良好，可用于酶活測定。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Glucose standard curve

將初篩獲得的4 株高產(chǎn)纖維素酶菌株在28 ℃，180 rpm 發(fā)酵培養(yǎng)5 d，測定各菌株CMC酶活力。菌株HF-3 的CMC 酶活力最高，為67.722 U/mL；其次為菌株Y5，為37.714 U/mL；菌株Y6，為30.694 U/mL；菌株Y2 的CMC 酶活力最低，為25.336 U/mL（表5）。

表5 高產(chǎn)纖維素酶菌株CMC 酶活力Table 5 CMC enzyme activity of the strain

2.4 菌株鑒定結(jié)果

通過分離純化，培養(yǎng)4 個(gè)菌株的菌落特征（生長速率、菌落質(zhì)地、顏色、氣味）等特征，初步 確 定Y2、Y5、Y6 為 放 線 菌(Actinomycete)，HF-3 為真菌，菌落形態(tài)如圖3 所示。

圖3 高產(chǎn)纖維素酶菌株菌落形態(tài)Fig. 3 Morphological characteristic of strain

采用試劑盒提取菌株DNA，分別以各菌株DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序，利用SeqMan 進(jìn)行序列拼接剪切，將結(jié)果輸入NCBI 網(wǎng)站，進(jìn)行同源性比對，同時(shí)下載同源序列，利用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4～7），確定菌株種類，具體鑒定結(jié)果如表6所示，HF-3 為密褐褶孔菌Gloeophyllum trabeum，Y5 為淺灰白鏈霉菌Streptomyces griseoloalbus、Y6 為絲狀鏈霉菌Streptomyces filamentosus和Y2為威德摩爾鏈霉菌Streptomyces wedmorensis。

表6 纖維素降解菌種類Table 6 The specie of cellulose degrading strain

圖4 Y2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Y2

3 結(jié)論與討論

在自然界中的纖維素主要靠細(xì)菌、放線菌、真菌都產(chǎn)生的孢外纖維素酶進(jìn)行降解，而高效降

解菌株的篩選是纖維素開發(fā)和利用的關(guān)鍵，本研究利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和剛果紅透明圈染色法，從土壤和實(shí)驗(yàn)室已有的木腐菌種中初步篩選出4 株較高產(chǎn)酶的纖維素降解菌株，4 株菌株在28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)5 d 后，孢外纖維素酶活性HE-3 菌株最高為67.772 U/mL，其它3 個(gè)菌株相對較高，Y5 為37.714 U/mL、Y6 為30.694 U/mL、Y2 為25.336 U/mL。通 過 菌 落 特征以及DNA 分子比對，對4 株菌株進(jìn)行了鑒定，HF-3 為密褐褶孔菌，Y5 為淺灰白鏈霉菌、Y6 為絲狀鏈霉菌和Y2 為威德摩爾鏈霉菌。

圖5 Y5 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of Y5

圖6 Y6 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of Y6

圖7 HF-3 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of HF-3

邵帥等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在不同的培養(yǎng)基中，菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性存在差異，因此優(yōu)化產(chǎn)酶條件是提高纖維素降解率的關(guān)鍵。Kato 等[21]研究表明 CSK1 單獨(dú)培養(yǎng)后進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解時(shí)，其效率顯著低于混合菌系；夏強(qiáng)[22]對3 株具有木質(zhì)纖維素降解功能的菌株進(jìn)行復(fù)配后得到的復(fù)合菌劑，對小麥秸稈中纖維素的降解率達(dá)到63.59%；由此可知復(fù)配是提高菌株降解的另一途徑。受此啟發(fā)，本研究后續(xù)將對4 個(gè)菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得高效產(chǎn)酶條件，并將4 個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)配研究，進(jìn)一步提高其對纖維素的降解能力。