榆跳象性信息素的提取及組分分析

李 彪, 張建英*, 楊貴軍, 郝鳳霞

(1.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.寧夏大學(xué)省部共建煤炭高效利用與綠色化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏 銀川 750021)

灰榆(Ulmusglaucescens)是寧夏賀蘭山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)最常見(jiàn)的一種喬木,尤其是在山體的向陽(yáng)面,灰榆是唯一的一種喬木.作為賀蘭山保護(hù)區(qū)內(nèi)最常見(jiàn)的一種喬木,灰榆是巖羊、馬鹿等許多動(dòng)物的食物來(lái)源,并且對(duì)山體植被覆蓋率有重要的影響.近年來(lái),由于賀蘭山植物群落單一,抑制害蟲(chóng)能力弱,灰榆林的專一性害蟲(chóng)榆跳象危害日趨嚴(yán)重.榆跳象(OrchestesalniLinnaeus)屬鞘翅目象蟲(chóng)科,是榆樹(shù)的重要食葉害蟲(chóng)之一[1],成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)均危害榆樹(shù)葉片.該蟲(chóng)在國(guó)內(nèi)分布于上海、江蘇、安徽、山東、天津、北京、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、陜西、寧夏等地[1—2].榆跳象1 a發(fā)生1代[3],以成蟲(chóng)越冬,越冬成蟲(chóng)于4月上旬開(kāi)始交配產(chǎn)卵,于4月中下旬幼蟲(chóng)孵化,以幼蟲(chóng)潛入榆樹(shù)葉肉內(nèi)危害[4].受害葉片表現(xiàn)為鼓起呈囊泡狀[5],嚴(yán)重時(shí)葉片脫落,有時(shí)整株死亡.5月中旬羽化成蟲(chóng)出現(xiàn)并危害葉片,成蟲(chóng)一般自葉背取食葉肉,葉子被害后僅留下表皮或呈網(wǎng)眼狀[1,4].以6月最嚴(yán)重，7月上旬成蟲(chóng)越夏.因榆跳象成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)均危害榆樹(shù)葉片,防治較為困難，目前主要通過(guò)化學(xué)方法防治[4,6].但在自然保護(hù)區(qū)、水源涵養(yǎng)地及人類活動(dòng)較為頻繁的地區(qū)，無(wú)法噴灑藥物防治害蟲(chóng),且不科學(xué)的化學(xué)防治易導(dǎo)致榆跳象產(chǎn)生抗藥性,致使現(xiàn)有的防治藥劑失去作用并對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害,因此迫切需要一種綠色無(wú)污染的方法防治榆跳象.通過(guò)性信息素制成性誘劑誘捕榆跳象,是一種高效且不污染環(huán)境的綠色防控方法.該方法有效地監(jiān)測(cè)和防治害蟲(chóng)的發(fā)生,且具有用量少、靈敏度高、針對(duì)性強(qiáng)和對(duì)環(huán)境友好、不傷益蟲(chóng)等特點(diǎn)[7].目前,對(duì)榆跳象的研究主要集中在其生活史及習(xí)性[1]、發(fā)生規(guī)律[2]、空間分布和防治方法及建議等方面[8],關(guān)于其性信息素成分方面的研究較少.筆者采用有機(jī)溶劑浸提法,從榆跳象雌蟲(chóng)腺體內(nèi)提取性信息素,通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定主要成分[7,9],確定榆跳象性信息素的主要成分,進(jìn)而為榆跳象信息素的合成及林間誘捕研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)蟲(chóng)源

榆跳象成蟲(chóng)采自寧夏賀蘭山國(guó)家自然保護(hù)區(qū).于2019年4—6月在保護(hù)區(qū)內(nèi)的灰榆(Ulmusglaucescens)上采集榆跳象成蟲(chóng),存放在裝有新鮮榆樹(shù)葉片的塑料管(高8 cm,內(nèi)徑2.5 cm)內(nèi),并用專用透氣蓋封口.在實(shí)驗(yàn)室解剖鏡下分辨雌雄,雌蟲(chóng)即為實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng).4—6月份的實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)分別為85，50，45只.

1.2 儀器和試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(Agilent,5977B)、解剖鏡、色譜進(jìn)樣瓶、解剖針、眼科手術(shù)剪、眼科鑷子、注射器(2.5 mL)、0.22 μm的一次性過(guò)濾器.

正己烷(色譜級(jí))、乙醇(分析純)、無(wú)水硫酸鈉(分析純).

1.3 提取方法

在解剖鏡下,用鑷子夾住雌性榆跳象成蟲(chóng)的胸部,再用解剖針輕壓蟲(chóng)體腹部，將擠壓出來(lái)的腺體用剪刀剪掉.將剪下來(lái)的腺體放入盛有正己烷的色譜瓶中浸泡，室溫下靜置3～5 h.用一次性注射器吸取上層清液.通過(guò)過(guò)濾處理,轉(zhuǎn)移至潔凈的色譜瓶中.在微弱的氮?dú)饬飨聺饪s至2 μL.通過(guò)GC-MS進(jìn)行性信息素成分的測(cè)定.

1.4 分析條件

DB-5MS毛細(xì)柱(30 m×250 μm×0.25 μm).升溫程序:40 ℃保持 3 min,然后每分鐘上升 6 ℃到 270 ℃,保持3 min.進(jìn)樣口溫度為260 ℃,溶劑延遲5 min.采集模式:SCAN,無(wú)分流進(jìn)樣,接口溫度為 250 ℃,離子源溫度為230 ℃.四極桿溫度為150 ℃,載氣為He,體積流量為 1 mL/min.EI 電子轟擊,檢測(cè)器電壓為350 V,發(fā)射電流為 150 μA.采集速度為 0.6 s/次.原子質(zhì)量單位采集范圍為 40～330 amu.通過(guò) NIST17軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析.

2 結(jié)果與分析

4—6月份的榆跳象性信息素粗提取物的總離子流圖見(jiàn)圖1～圖3,分別得到5，6，6種榆跳象性信息素組分,進(jìn)一步確定這些物質(zhì)的名稱及結(jié)構(gòu)(表1～表3).

圖1 4月份榆跳象性信息素粗提取物的總離子流圖

圖2 5月份榆跳象性信息素粗提取物的總離子流圖

圖3 6月份榆跳象性信息素粗提取物的總離子流圖

表1 4月份榆跳象性信息素粗提取物的性信息素組分

表2 5月份榆跳象性信息素粗提取物的性信息素組分

表3 6月份榆跳象性信息素粗提取物的性信息素組分

3 結(jié)論與討論

采用有機(jī)溶劑浸提法提取榆跳象性信息素,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)不同采集時(shí)間樣本進(jìn)行3次GC-MS分析.結(jié)果表明,4月份粗提取物中得到5種性信息素疑似物,5,6月份均得到6種性信息素疑似物.正二十七烷、2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基)苯酚、11,13-二甲基-12-乙酸酯、順-9-十四碳烯酸異丁酯、1-二十二醇這5種化合物在3次檢測(cè)分析結(jié)果中都存在,亞麻酸在后2次檢測(cè)中存在.第1次提取物的可識(shí)別物質(zhì)峰多,化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,有助于物質(zhì)識(shí)別分析,而后2次物質(zhì)的峰少且雜質(zhì)少,但樣品中的物質(zhì)成分與性信息素成分更接近.

已知的昆蟲(chóng)性信息素主要成分為不飽和醇、醋酸酯、醛或酮類,所含雜質(zhì)多為長(zhǎng)鏈烷烴和油酸類物質(zhì)[10—12].亞麻酸在第2次檢測(cè)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)50%,在第3次檢測(cè)中為25.94%，不符合性信息素是某一性別昆蟲(chóng)分泌于體外,能被同種異性個(gè)體所接受,并引起異性個(gè)體產(chǎn)生一定的行為和生理反應(yīng)的微量化學(xué)物質(zhì)的定義[9,11—13],由此可排除疑似物中的正二十七烷和亞麻酸.同時(shí),昆蟲(chóng)性信息素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有較大的相似性[10]：大多是由10～21個(gè)碳原子組成的直鏈化合物[11,14];含有1～3個(gè)碳碳雙鍵且位置多在5,7,9或11位上,分子構(gòu)型多為順式;功能基多由伯醇及其乙酸酯等構(gòu)成[14].因此,該實(shí)驗(yàn)提取物中2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基)苯酚、1-二十二醇不符合性信息分子所具有的共同特征.而11,13-二甲基-12-乙酸酯、順-9-十四碳烯酸異丁酯滿足昆蟲(chóng)性信息素所具有的一般特征,且3次檢測(cè)到的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低,分別為1.23%,0.56%,1.52%;0.07%,0.05%,0.38%,符合性信息素是昆蟲(chóng)分泌于體外的微量化學(xué)物質(zhì)這一特征.

3次GC-MS分析得到的11,13-二甲基-12-乙酸酯、順-9-十四碳烯酸異丁酯都為酯類物質(zhì),這與鞘翅目昆蟲(chóng)銅綠麗金龜和華北大黑鰓金龜?shù)男孕畔⑺氐某煞窒嗨芠15—16].已知的象甲科的華山松木蠹象(Pissodespunctatus)的性信息組分有十六碳烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、十八碳烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、十八碳二烯酸甲酯等物質(zhì)[17—18];甘薯象甲(Cylasformicarius)的性信息素成分有(Z)-3-十二碳烯基(E)-2-丁烯酸酯.上述2種象甲科昆蟲(chóng)的性信息素提取部位與該實(shí)驗(yàn)相同,都是雌蟲(chóng)腺體,且性信息素成分與該研究分析得到的物質(zhì)相同(酯類物質(zhì)),大灰象甲(Sympiezomiasvelatus)性信息素成分暫未確定,但得到了相關(guān)化合物,如2-壬烯-1醇、7-甲基-Z-十四碳烯-1-醇乙酸酯等[19].一般，昆蟲(chóng)性信息素中大多有2種或2種以上的化學(xué)成分,很少有1種化學(xué)成分[11,14].綜上所述,該實(shí)驗(yàn)中3次檢測(cè)得到的性信息素疑似組分11,13-二甲基-12-乙酸酯和順-9-十四碳烯酸異丁酯,可以初步確定為榆跳象性信息素疑似物.

采用有機(jī)溶劑浸提法提取的榆跳象性信息受雜質(zhì)的影響,可能存在微量物質(zhì)缺失且缺乏榆跳象性信息素對(duì)比的參照物質(zhì)問(wèn)題.因此,還需通過(guò)觸角電位,合成性信息素后進(jìn)行誘捕實(shí)驗(yàn)等,進(jìn)行進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證.