小鼠呼吸機(jī)誘導(dǎo)的肺損傷相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

摘要目的：探討呼吸機(jī)誘導(dǎo)的肺損傷VILI的致病機(jī)制， 并鑒定相關(guān)標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究和臨床理論提供基礎(chǔ)。方法：首先從NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）公共數(shù)據(jù)平臺(tái)GEO（Gene Expression Omnibus）下載基因芯片數(shù)據(jù)集GSE9314。然后使用在線分析工具GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并獲得正常肺組織和肺損傷組織之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。接著用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行功能性注釋（GO），通路分析（KEGG）.最后通過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析并識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。結(jié)果：初步篩選出583個(gè)（p<0.05）差異基因的變化超過一倍，Kegg分析表明，差異基因主要參與TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑，以及Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑。而蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析鑒定了十個(gè)核心基因，分別為Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b。結(jié)論：通過生物信息學(xué)分析小鼠肺損傷基因芯片數(shù)據(jù)的差異基因，鑒定的核心基因與相關(guān)通路參與VILI的發(fā)病過程，表明其可能是肺損傷發(fā)病機(jī)制的研究新靶點(diǎn).

關(guān)鍵詞：生物標(biāo)志物，預(yù)后，呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷

呼吸機(jī)誘發(fā)的肺損傷（VILI）是與機(jī)械通氣相關(guān)的最嚴(yán)重且發(fā)病率較高的并發(fā)癥之一[1]。機(jī)械通氣下急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者VILI的發(fā)生率估計(jì)為86%。涉及在插管期間接受機(jī)械通氣的外科手術(shù)患者的研究發(fā)現(xiàn)，6.2% 至 24% 的患者發(fā)展為 ALI。因此，研究VILI的分子機(jī)制和致病相關(guān)基因?qū)τ谡_管理呼吸系統(tǒng)疾病非常重要。

先前的研究表明，保護(hù)性通氣肺中IL-6、IL-8和IL-1β的血漿水平降低，并且該水平與更好的臨床結(jié)果相關(guān)[2]。華萊士 MJ 等。揭示CTGF、CYR61 和 EGR1 可能是早期肺損傷的新標(biāo)志物[3]。然而，目前預(yù)后工具的效率相對(duì)有限，因此需要在 VILI 患者中使用更敏感和特異的分子生物標(biāo)志物。在這里，我們篩選了VILI 中的十個(gè)關(guān)鍵基因（Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b）。這些結(jié)果可能為潛在的免疫學(xué)機(jī)制提供新的見解，并為 VILI 提供潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。

1數(shù)據(jù)與方法

1.1數(shù)據(jù)

NCBI公共數(shù)據(jù)平臺(tái)GEO是最大和最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)資源。以“呼吸機(jī)性肺損傷”為搜索關(guān)鍵詞，選擇種屬為小鼠，以“陣列表達(dá)譜”為檢測(cè)類型，得到數(shù)據(jù)集GSE9314。該數(shù)據(jù)集來自弗吉尼亞醫(yī)學(xué)院，包含4對(duì)VILI和匹配的對(duì)照肺組織樣本。

1.2 研究方法

1.2.1差異基因篩選及數(shù)據(jù)處理

為篩選出正常肺組織和 VILI 肺組織的差異基因。本研究使用在線工具GEO2R來進(jìn)行差異分析。然后將基因表達(dá)的差異表示為倍數(shù)變化 （fold change）。| log fold change |> 1，P <0.05作為過濾條件，基于 R語言程序結(jié)合pheatmap包用于差異基因可視化，以及繪制火山圖和熱圖。

1.2.2 GO富集分析和KEGG通路分析

將DEGs數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，然后我們進(jìn)行GO分析（基因本體分析），并使用KEGG（京都基因和基因組百科全書）對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集。GO富集分析包括三部分，分別為生物過程、細(xì)胞組成和分子功能。通路富集根據(jù) P值顯示前10條通路。此外，我們使用 R（版本 3.6.1）為 GO 富集分析和KEGG信號(hào)通路分析繪制了條形圖。

1.2.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)建設(shè)和模塊分析

我們使用檢索基因相互作用的搜索工具STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置置信度得分> 0.7的交互被選為對(duì)研究具有高置信度.來分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）對(duì)并構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，然后選擇連通性得分>2的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 確定DEG并進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析

GEO數(shù)據(jù)平臺(tái)中獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的基因芯片數(shù)據(jù)集1個(gè)GSE9314.經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后對(duì)其進(jìn)行DEG分析，篩選出583個(gè)基因.

為了進(jìn)一步了解 DEG 的主要生物學(xué)過程（biological process），分子功能（molecular function）以及細(xì)胞組成（cellular component），我們進(jìn)行了GO富集分析。GO分析的細(xì)胞組成部分顯示 DEG 位于細(xì)胞膜上（圖 2C）并且與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)（圖 2B）。DEG主要參與趨化因子活性、脂多糖結(jié) 合、生長(zhǎng)因子活性-體結(jié)合和肽酶抑制劑活性（圖 2A）。另一方面，KEGG分析顯示調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的通路，如TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)以及NOD樣受體信號(hào)通路顯著豐富（圖2D））。

2.2 DEG的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了尋找其他相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)并探索關(guān)鍵信號(hào)通路，我們將DEG導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫以獲得PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。結(jié)果顯示，大部分蛋白間都存在著相互作用，且有多個(gè)蛋白位于網(wǎng)絡(luò)中心.按照互作關(guān)系從多到少的原則， 我們將 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 確定為網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因.

3 討論

VILI 是與機(jī)械通氣 （MV） 相關(guān)的最常見并發(fā)癥。盡管機(jī)械通氣是治療呼吸功能不全的最有效療法，但仍會(huì)增加患者的發(fā)病率和死亡率。許多有前途的重要生物介質(zhì)已被確定為基礎(chǔ)科學(xué)的顯著成就 （4）。因此，探索與 VILI 相關(guān)的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物非常重要。在這項(xiàng)研究中，與來自微陣列數(shù)據(jù)集GSE9314的正常肺組織相比，在VILI的肺組織中鑒定了583個(gè)DEG和十個(gè)關(guān)鍵基因。這些DEGs主要富集在啟動(dòng)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的生物過程中，與TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等通路密切相關(guān)。表明這些基因可能在 VILI 的免疫機(jī)制中具有重要功能。

盡管這十個(gè)基因的表達(dá)升高影響了VILI患者的免疫機(jī)制，但其主要原因和潛在的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。CXCL1、IL1b、CXCL2細(xì)胞與免疫相關(guān)通路的交叉表明，兩條常見的通路是NOD樣受體信號(hào)通路和IL-17信號(hào)通路。這兩種途徑也與免疫反應(yīng)有關(guān)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn) CXCL1、IL1b、CXCL2、IL6 的表達(dá)上調(diào)，這可能觸發(fā) VILI 中 IL-17 信號(hào)的激活。盡管如此，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和研究來驗(yàn)證樞紐基因并闡明這些基因?qū)?VILI 的調(diào)控機(jī)制。

總之，我們的研究確定了在VILI肺組織中觸發(fā)的DEG和關(guān)鍵基因。對(duì)基因表達(dá)和功能的綜合分析證明了參與 VILI 進(jìn)展的機(jī)制。我們的結(jié)果表明 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 是預(yù)測(cè) VILI 預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。需要進(jìn)一步的研究來闡明中樞基因在 VILI 發(fā)展中執(zhí)行的確切分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]Lionetti V， Recchia FA， Ranieri VM. Overview of ventilator-induced lung injury mechanisms. Curr Opin Crit Care. 2005;13（1）：82–86. doi：10.1097/00075198-200502000-00013.[PubMed] [CrossRef][Google Scholar]

[2]Frank JA， Parsons PE， Matthay MA. Pathogenetic significance of biological markers of ventilator-associated lung injury in experimental and clinical studies. Chest. 2006;130（6）：1906‐1914. doi：10.1378/chest.130.6.1906

[3]Wallace MJ， Probyn ME， Zahra VA， et al. Early biomarkers and potential mediators of ventilation-induced lung injury in very preterm lambs. Respir Res. 2009;10（1）：19. Published 2009 Mar 10. doi：10.1186/1465-9921-10-19

[4]Dos Santos CC， Slutsky AS. The contribution of biophysical lung injury to the development of biotrauma. Annual Review of Physiology 2006; 68：585–618.

作者簡(jiǎn)介：龍姣 女 漢族 湖南長(zhǎng)沙 （1990年5.） 碩士 住院醫(yī)師 中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院（廣東深圳）518107 研究方向：肺損傷 寫作方向：肺損傷。