變應(yīng)性鼻炎患兒外周血miRNA-21表達(dá)水平及其臨床意義

顧 挺, 劉曉慶, 曹 鳳, 張峰波

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗科, 新疆 烏魯木齊, 830054;2. 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市水磨溝區(qū)人民醫(yī)院 檢驗科, 新疆 烏魯木齊, 830054)

變應(yīng)性鼻炎(AR)是機(jī)體接觸特定變應(yīng)原后由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎癥性疾病，鼻黏膜常伴有嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)的聚集[1]。AR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病理過程中涉及到多種炎癥介質(zhì)和免疫細(xì)胞的參與[2]。微小核糖核酸(miRNAs)是一種具有調(diào)控功能的小分子RNA, 與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及炎癥反應(yīng)等多種生理功能密切相關(guān)[3-4]。近年來相關(guān)研究[5]表明, miRNA-21參與EOS的發(fā)育、活化等生物學(xué)過程。AR對兒童的智力發(fā)育、性格特征及生活質(zhì)量等影響較大[6-7], 一項研究[7]對111例AR兒童進(jìn)行了3年隨訪，發(fā)現(xiàn)AR兒童哮喘及慢性咳嗽發(fā)病率均顯著升高，說明對AR患兒的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究至關(guān)重要。本研究探討了AR患兒外周血miRNA-21表達(dá)水平及其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2019年1月本院耳鼻咽喉頭頸外科及兒科收治的108例AR患兒納入AR組，另選取同期在體檢中心體檢的45例健康兒童納入對照組。AR患兒納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合《兒童變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2010年，重慶)》[8]中的AR診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床癥狀符合鼻塞、鼻癢、噴嚏及流涕4個癥狀中的至少2個癥狀，且每天癥狀持續(xù)時間超過1 h, 吸入變應(yīng)原血清特異性IgE(sIgE)或吸入變應(yīng)原皮膚點刺試驗陽性者; ② 近1個月內(nèi)未系統(tǒng)或局部應(yīng)用激素、抗組胺藥物等者; ③ 未合并鼻黏膜急慢性感染性疾病、支氣管哮喘及特應(yīng)性皮炎等病史患者; ④ 無其他自身免疫性疾病及惡性腫瘤等病史患者。AR組男56例，女52例，年齡4～14歲，平均(8.44±1.11)歲; 對照組男20例，女25例，年齡5～13歲，平均(7.15±1.56)歲。2組研究對象在年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 2組研究對象家長均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 治療方法

AR組患兒采用丙酸氟替卡松鼻噴劑(Glaxo Wellcome S. A. , 國藥準(zhǔn)字H20130190, 50 g/噴)聯(lián)合孟魯司特鈉咀嚼片(默沙東，國藥準(zhǔn)字J20130053, 規(guī)格4或5 mg/片)治療。丙酸氟替卡松鼻噴劑用法為每側(cè)鼻孔1噴/次, 1次/d; 孟魯司特鈉咀嚼片每日口服, 5 mg/次(6歲及以上)或4 mg/次(6歲以下)，共治療4周。參考蘭州標(biāo)準(zhǔn)[9], 療效指數(shù)=(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%, 療效指數(shù)>66%為顯效，療效指數(shù)26%～66%為有效，療效指數(shù)<26%為無效。

1.3 外周血miRNA-21水平檢測

1.3.1 血清標(biāo)本收集: 治療前1 d和治療4周后，清晨空腹抽取所有研究對象外周靜脈血3 mL, 離心10 min, 移液管取上層血清置入新的無RNA酶EP管中并再次離心10 min, 再次用移液管取上層血清置入新的無RNA酶EP管中，所有標(biāo)本置入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA提取及濃度測定: 取出樣本后快速解凍，依次加入700 mL Trizol和0.2 mL氯仿震蕩2 min, 靜置后離心，移液管取上層水相置入含有等體積的異丙醇的EP管中并離心5 min, 棄上清后使用1 mL 75%酒精[焦碳酸二乙酯(DEPC)水配置]洗滌沉淀，加入25 mL ddH2O溶解RNA?？俁NA濃度=吸光度A260/吸光度A280, 當(dāng)數(shù)值為1.8～2.2繼續(xù)下一步實驗。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系: miScript Hispct(5×) 4 mL, miScript Nucleics(10×) 2 mL, miScript Reverse Transcriptase 2 mL, RNA模板12 mL。逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 60 min, 95 ℃ 10 min, 最后加入80 mL ddH2O稀釋。定量PCR反應(yīng)體系10 μL, 預(yù)加熱95 ℃, 30 min, 變性94 ℃, 15 s, 退火55 ℃, 30 s, 延伸70 ℃, 30 s, 一共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參, miRNA-21的相對表達(dá)量為2-△Ct=CtmiRNA-21-CtU6。miScript II RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miScript SYBR Green試劑盒購于QIAGEN公司(德國)。

1.4 EOS計數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)、總IgE(TIgE)水平檢測

常規(guī)取外周靜脈血5 mL于試管中, 4 ℃靜置1 h后離心并分離出血清置于2 mL EP管中，EP管置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。血清ECP、TIgE水平由本院檢驗科采用UniCAP100全自動免疫分析儀(瑞典，Pharmacia公司)檢測; EOS計數(shù)來源于血常規(guī)檢測報告單，血常規(guī)采用HB-7021檢測儀(中國，英諾華公司)檢測。

1.5 AR患兒鼻炎癥狀嚴(yán)重程度評估

AR兒童癥狀評分采用視覺模擬評分法(VAS)評估，癥狀包括鼻塞、流涕、噴嚏及鼻癢共4個項目，每項按照0～10分進(jìn)行評估, 0分表示輕度, 10分表示重度, 4項癥狀累計積分為VAS總分?？偡种翟酱蟊硎静∏樵絿?yán)重[10]。為避免誤差，所有AR患兒的VAS評分均由同一人完成評估。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血清miRNA-21、ECP、TIgE、外周血EOS計數(shù)及VAS總分水平比較

AR組患兒治療4周后，顯效、有效和無效分別為84例、15例和9例，顯效率為77.78%。AR組治療前的miRNA-21、ECP、TIgE及外周血EOS計數(shù)水平均高于治療后及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); AR組患兒治療后僅miRNA-21表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 其他指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 治療后, AR組患兒VAS評分低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組miRNA-21、ECP、TIgE、EOS計數(shù)及VAS總分水平比較

2.2 AR患兒VAS評分與miRNA-21、EOS計數(shù)、ECP、TIgE的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示, AR患兒治療前VAS評分與miRNA-21(r=0.568,P<0.001)、EOS計數(shù)(r=0.433,P=0.026)、ECP(r=0.352,P=0.014)均呈顯著正相關(guān)，但與TIgE無相關(guān)性(r=0.168,P=0.135); AR患兒治療后VAS評分與miRNA-21、EOS計數(shù)、ECP、TIgE均無相關(guān)性(r=0.423、0.532、0.427、0.368,P>0.05)。

2.3 EOS計數(shù)、TIgE、ECP和miRNA-21水平評估AR患兒治療后顯效的ROC曲線

將108例AR患兒治療前EOS計數(shù)、TIgE、ECP、miRNA-21數(shù)值作為檢驗變量，治療4周后84例AR患兒達(dá)到顯效為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn), miRNA-21、ECP、EOS計數(shù)、TIgE評估AR患兒治療后顯效的曲線下面積(AUC)分別為0.913(95%CI為0.868～0.986,P<0.05)、0.859(95%CI為0.769～0.910,P<0.05)、0.694(95%CI為0.495～0.793,P<0.05)、0.688(95%CI為0.591～0.785,P<0.05)。miRNA-21的AUC大于ECP、EOS計數(shù)和TIgE, ECP的AUC大于EOS計數(shù)、TIgE, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); EOS計數(shù)的AUC與TIgE相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表2 4種指標(biāo)對AR患兒治療后顯效的評估效能

2.4 miRNA-21和ECP聯(lián)合檢測評估AR患兒治療后顯效的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析結(jié)果顯示, miRNA-21、ECP對AR患兒治療后顯效有顯著影響(P=0.012、0.023), 見表3。建立聯(lián)合預(yù)測因子模型: logt(P)=-4.488+0.684×miRNA-21+0.156×ECP, 將原始數(shù)值代入模型后得出的結(jié)果Y作為新變量，新變量Y評估AR患兒治療后顯效的AUC為0.984(95%CI為0.863～0.995,P<0.05), 診斷靈敏度為94.75%時，特異度可達(dá)90.52%。

表3 miRNA-21、ECP評估AR患兒治療后顯效的Logistic回歸分析

3 討 論

AR是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，鼻黏膜炎性細(xì)胞浸潤是其主要特征，當(dāng)機(jī)體接觸特定變應(yīng)原后誘發(fā)EOS分化成熟并脫顆粒引起ECP等物質(zhì)的釋放，因此, EOS、ECP及TIgE等共同參與了AR的發(fā)病過程[11]。此外, AR患兒日后發(fā)生哮喘、抑郁的風(fēng)險顯著升高[12-13], 因此對AR患兒進(jìn)行早期診斷、治療及臨床療效評估尤為重要。

miRNA為一種非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA, 在機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中的調(diào)控作用最為顯著[4]。多種類型的miRNA在AR的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用, YU S Q等[14]發(fā)現(xiàn)AR患者鼻黏膜組織中421個miRNA表達(dá)水平存在差異，其中呈現(xiàn)2倍數(shù)量變化的miRNA有9種，其中miRNA-9表達(dá)水平顯著上調(diào)，而miRNA-187、miRNA-143等表達(dá)水平顯著下調(diào)。艾紅輝等[15]發(fā)現(xiàn), AR患者血清miR-155表達(dá)水平是對照組的2倍，且miR-155與患者EOS計數(shù)呈顯著正相關(guān)(r=0.346)。羅燕云等[16]報道，采用miRNA-135a類似物治療20 d后, AR小鼠血清中IgE水平及鼻黏膜組織中炎癥因子IL-4 mRNA表達(dá)水平均顯著降低。因此，不同類型的miRNA在AR的發(fā)病機(jī)制中可能起著不同的作用。目前，關(guān)于miRNA-21與氣道炎癥性疾病相關(guān)性的研究不多, ELBEHIDY R M等[17]證實miRNA-21可作為診斷哮喘患兒及評估其臨床療效的一項血清學(xué)標(biāo)志物, LU T X等[18]發(fā)現(xiàn)miRNA-21在過敏性氣道炎癥小鼠組織中高表達(dá)，可能與其上調(diào)IL-12p35表達(dá)有關(guān)，其他研究[19]也證實miRNA-21參與了機(jī)體局部炎癥反應(yīng)維持和放大的病理過程。

本研究分析108例AR患兒外周血miRNA-21表達(dá)水平發(fā)現(xiàn), AR患兒miRNA-21表達(dá)水平顯著升高，當(dāng)采用激素聯(lián)合抗組胺藥物的標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療后, miRNA-21表達(dá)水平顯著下降。本研究還發(fā)現(xiàn), AR組患兒治療前EOS、ECP、TIg水平高于治療后及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); AR組患兒治療后EOS、ECP、TIg水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 但miRNA-21表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。劉怡君等[20]和RONDN C等[21]也證實，AR患者臨床緩解后EOS、ECP、IgE水平均顯著降低，與本研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn), AR患兒治療前miRNA-21、ECP、EOS與VAS總分均呈顯著正相關(guān)，但AR患兒臨床緩解后上述指標(biāo)與VAS總分均無相關(guān)性，提示miRNA-21、ECP、EOS可在一定程度上反映AR患兒病情的嚴(yán)重程度。AR患兒經(jīng)過治療且取得臨床緩解后，血清miRNA-21水平仍顯著高于健康對照組，提示miRNA可能參與了AR的發(fā)病機(jī)制。LU T X等[22]發(fā)現(xiàn), miRNA-21主要是在調(diào)節(jié)祖細(xì)胞向成熟EOS定向分化過程中起到一定作用, miRNA-21基因敲除后EOS祖細(xì)胞生長受限且細(xì)胞凋亡率升高，動物實驗發(fā)現(xiàn)小鼠外周血中EOS計數(shù)水平及骨髓中EOS克隆形成能力均顯著降低。由此提示, AR患兒外周血EOS計數(shù)升高的主要原因可能與血清中miRNA-21表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。

糖皮質(zhì)激素聯(lián)合抗組胺藥物是治療AR患兒的一線藥物方案，但不同AR患兒采用標(biāo)準(zhǔn)治療方案的療效存在差異[23]。目前評估AR患兒臨床療效的生物學(xué)標(biāo)志物較少，本研究采用ROC曲線分析miRNA-21、ECP、EOS計數(shù)、TIgE指標(biāo)對AR患兒治療后顯效的預(yù)測效能發(fā)現(xiàn), miRNA-21、ECP的AUC較大，且均顯著大于其他2種指標(biāo)，因此臨床醫(yī)生可單獨(dú)采用miRNA-21或ECP預(yù)測AR患兒的臨床療效。miRNA-21聯(lián)合ECP預(yù)測AR患兒臨床療效的AUC為0.984(95%CI為0.863～0.995,P<0.05), 診斷靈敏度、特異度分別為94.75%、90.52%, 故臨床可聯(lián)合采用miRNA-21和ECP預(yù)測AR患兒的臨床療效。

綜上所述, AR患兒血清miRNA-21表達(dá)水平顯著升高，且miRNA-21與AR病情嚴(yán)重程度具有一定相關(guān)性，單獨(dú)應(yīng)用miRNA-21或聯(lián)合應(yīng)用ECP與miRNA-21可較好地預(yù)測AR患兒的臨床療效。但本研究樣本量較小，且未對miRNA-21參與AR發(fā)病過程的機(jī)制進(jìn)行探討，未來有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。