李敏,李忠信,楊會舉#
1 河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院肛腸科,鄭州450000
2 漯河市臨潁縣第二人民醫(yī)院肛腸科,河南 漯河4620000
結直腸癌是中國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢。結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程,目前尚不清楚其發(fā)病機制。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類轉錄體長度大于200 nt 的RNA,不編碼任何蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA 在細胞周期調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控、轉錄后調(diào)控等生物學過程中發(fā)揮著重要作用,尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。LINC00261 是一個位于20p11.21 上的基因間lncRNA,LINC00261在多種腫瘤中起著促癌基因的作用。Fan 等發(fā)現(xiàn)LINC00261 在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織,并能上調(diào)Slug 蛋白的表達,從而促進胃癌細胞上皮-間充質(zhì)轉化進程。抑制LINC00261 表達可促進結直腸癌細胞凋亡,并增加對化療藥物順鉑的敏感性。然而,目前尚不清楚LINC00261在結直腸癌中的作用,因此本研究擬探討lncRNA LINC00261 在結直腸癌中的表達及其臨床意義,現(xiàn)報道如下。
選取2017 年7 月至2020 年7 月于河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院接受手術切除術的86 例結直腸癌患者。納入標準:均經(jīng)病理組織學診斷為結直腸癌。排除標準:①合并其他惡性腫瘤;②術前已接受過放療、化療等其他治療干預。86 例結直腸癌患者中,男47 例,女39 例;年齡35~75 歲,平均(58.26±11.63)歲;根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)組織學標準,低分化31 例,中分化42 例,高分化13 例;美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)TNM 分期:Ⅰ期18 例,Ⅱ期44例,Ⅲ期24 例。收集86 例結直腸癌患者術中留取的結直腸癌組織及癌旁組織石蠟標本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者知情同意并簽署知情同意書。
按照原位雜交試劑盒(購自武漢博斯特有限公司)說明書進行操作,石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合,用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水沖洗3 次,每次5 分鐘,然后在室溫下用3%過氧化氫處理10 分鐘,以消除內(nèi)源性過氧化物酶,用DEPC 水沖洗3 次,逐滴添加30 μl 用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶,37 ℃孵育20 分鐘,DEPC 水沖洗3次,1%多聚甲醛室溫下固定10 分鐘,DEPC 水沖洗3 次,然后將20 μl 預雜交溶液逐滴添加到每個切片中,并在37 ℃孵箱中進行預雜交,2~4 小時后添加20 μl 探針雜交溶液(購自武漢博斯特有限公司),37 ℃孵育過夜。次日,使用由高到低濃度的檸檬酸鈉緩沖液進行梯度洗脫,除去多余的探針,然后向切片中滴加50μl 封閉液,在37 ℃環(huán)境下封閉30 分鐘,然后逐滴添加50μl 生物素化的小鼠抗人地高辛抗體,并在37 ℃環(huán)境下孵育120 分鐘,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)沖洗3次,每次5 分鐘,滴加50 μl 鏈球菌親和素-生物素復合物,在37 ℃環(huán)境下孵育30 分鐘,PBS 沖洗3次,逐滴添加生物素化過氧化物酶50 μl,在37 ℃環(huán)境下孵育30 分鐘,PBS 沖洗3 次,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色5 分鐘,蘇木素復染,干燥透明后,用中性樹脂封片。
以探針雜交溶液替換為無探針雜交前溶液作為陰性對照,隨機選取5 個高倍視野(×400),采用免疫組織化學染色,根據(jù)染色強度計分:細胞無染色,計0 分;細胞呈淺棕色,計1 分;細胞呈棕色、無背景色或細胞呈深褐色、背景為淺棕色,計2 分;細胞呈深褐色,無背景色,計3 分。按陽性細胞占比計分:無陽性細胞,計0 分;陽性細胞占比≤25%,計1 分;25%﹤陽性細胞占比﹤50%,計2 分;陽性細胞占比≥50%,計3 分。二者之積為最終得分,即0~1 分為陰性,2~3 分為弱陽性,4~7 分為陽性,≥8 分為強陽性。
χ
=53.751,P
﹤0.01)。(圖1)圖1 原位雜交技術檢測LINC00261在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況(HE染色,×400)
P
﹤0.05);不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑的結直腸癌患者結直腸癌組織中LINC00261 陽性表達率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P
﹥0.05)。(表1)表1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中LINC00261 表達情況的比較(n=86)
結直腸癌的發(fā)病率和病死率都很高,而且近年來呈年輕化趨勢增長。早期結直腸癌手術加放化療治愈率高,但復發(fā)和轉移的結直腸癌仍然很難治愈,因此,迫切需要新的早期診斷、預測預后的標志物。
lncRNA 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關系密切,越來越多的證據(jù)表明,失調(diào)的lncRNA 與腫瘤的發(fā)病、復發(fā)和預后不良有關,可作為腫瘤早期診斷的新型生物標志物。LINC00261 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關的lncRNA。在乳腺癌細胞中,沉默LINC00261 可顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲,誘導G/G期阻滯,促進細胞凋亡,抑制細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2,CDK2)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、MMP9、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)表達,增強上皮鈣黏素(E-cadherin)表達。在人胰腺癌和人肺癌細胞系中,抑制LINC00261 表達可抑制細胞的侵襲和遷移能力。上述研究表明,LINC00261 影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而,目前尚不清楚LINC00261 在結直腸癌中的作用。
本研究應用原位雜交技術檢測lncRNA LINC00261 的表達,原位雜交是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交,再應用標記物相關的檢測系統(tǒng),在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術,其具有較高的靈敏度和特異度,可作為半定量檢測方法。本研究結果顯示,LINC00261在結直腸癌組織中陽性表達率為62.79%(54/86),明顯高于癌旁組織的8.14%(7/86),差異有統(tǒng)計學意義(P
﹤0.01)。表明LINC00261在結直腸癌組織中的表達水平明顯升高,與結直腸癌的發(fā)生有關,這可能是由于高表達的LINC00261 抑制相關蛋白的合成,進而導致細胞生物學功能的改變,最終使細胞發(fā)生癌變。本研究進一步分析了不同臨床特征結直腸癌患者癌組織中LINC00261 表達情況,結果發(fā)現(xiàn),不同分化程度、不同TNM 分期、是否發(fā)生淋巴結轉移的結直腸癌患者癌組織中LINC00261 的陽性表達率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P
﹤0.05),即分化程度越低、TNM 分期越高、有淋巴結轉移,則結直腸癌患者癌組織中LINC00261 陽性表達率越高,其中分化程度、TNM 分期是腫瘤惡性生物學行為的表現(xiàn),且淋巴結轉移是結直腸癌患者預后不良的重要指標,提示LINC00261 的異常表達可能預示著結直腸癌患者預后不良。由此,LINC00261 有可能作為預測結直腸癌患者不良預后的潛在生物標志物。綜上所述,LINC00261 在結直腸癌組織中的表達明顯升高,與結直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關,其有可能成為結直腸癌潛在的診斷標志物。本研究在今后也將擴大樣本收集量,以進一步確認LINC00261 表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系,并對相關機制進行深入研究。