1 株高滴度噬斑型三型副流感病毒野毒株的分離純化及鑒定

火文，關(guān)文竹，王云瑾，韓平，馬超，包紅，寇桂英，李雄雄，鞏晗博，白慕群

1.蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046 2.阿爾伯塔大學理學院，阿爾伯塔省加拿大T6G2R3

人三型副流感病毒（human parainfluenza virus type 3，HPIV-3）是僅次于呼吸道合胞病毒的、引起5歲以下嬰幼兒急性下呼吸道嚴重疾病的病原體，主要可致嬰幼兒肺炎和支氣管炎［1］。每年均會出現(xiàn)HPIV-3 的暴發(fā)，主要發(fā)生在春夏兩季［2-4］。急性呼吸道感染住院患兒中HPIV-3 感染非常普遍，流行病學研究顯示，HPIV-3 感染的患者中80%均是5 歲以下嬰幼兒［5］，造成了較大的疾病和經(jīng)濟負擔。有研究顯示，美國2011—2019 年間共檢測了2 700 萬份下呼吸道感染住院患兒的下呼吸道標本，HPIV-3 陽性標本超過67 000 份，陽性率為2.5%［6］。中國湖南一項下呼吸道感染住院患兒副流感病毒感染的流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，HPIV-3 感染率為13.8%［7］。中國廣州一項流行病學調(diào)查顯示，2009—2016 年間，下呼吸道感染住院患兒中HPIV-3 的感染率為4.4%［8］。另外，HPIV-3 感染還是導(dǎo)致老年慢性病患者和免疫力低下成年人下呼吸道疾病和死亡的重要原因［9］，在器官移植和免疫抑制患者中，HPIV-3 感染導(dǎo)致的死亡率在3% ~ 47%不等［10-11］。至目前為止，尚無治療HPIV-3 感染的特效藥物和預(yù)防性疫苗上市，因此疫苗的開發(fā)研究非常必要。本研究分離出1 株可在體外長期傳代的高滴度HPIV-3 病毒株，為HPIV-3疫苗的研發(fā)以及動物模型和檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 下呼吸道感染住院患兒下呼吸道分泌物標本2 037 份，由甘肅省婦幼保健醫(yī)院收集并提供；下呼吸道分泌物標本3 000 份，由甘肅省疾控中心收集并提供。均收集于預(yù)先裝有2 mL DMEM培養(yǎng)基的離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞 人胚肺二倍體成纖維細胞（WI-38）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、恒河猴腎細胞（MA104）均由蘭州生物制品研究所有限責任公司第二研究室保存并提供。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM ／MEM ／RPMI1640 細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；胰酶、低熔點瓊脂糖購自美國Sigma 公司；RNA 提取試劑盒RNeasy mini kit 購自美國 Qiagent 公司；one-step PrimeScript RTPCR Kit（RR055A）、one-step PrimeScript real-time RTPCR Kit（RR064A）和Ex TaqE（DRR100B）購自寶生物工程（大連）有限公司；去支原體抗生素Plasmocin購自美國Invivogen 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG、FITC 標記的兔抗羊IgG（A16143）、羊抗HPIV-3 全病毒抗體（PA1-73041）購自美國Thermo Fisher 公司；兔抗重組HPIV-3 HN 蛋白多克隆抗體和兔抗重組F 蛋白多克隆抗體由蘭州生物制品研究所有限責任公司第二研究室制備；Western blot 顯色底物Lumi-Light Western blotting substrate和凝膠成像儀購自美國GE 公司；細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶和兩層細胞工廠均購自美國Corning 公司；實時定量PCR 擴增儀購自美國AB 公司；PCR 擴增儀購自美國BIO RAD 公司；Casy 細胞計數(shù)儀購自德國INNOVATIS 公司。

1.4 HPIV-3 培養(yǎng)液RNA 提取 用RNeasy mini kit進行提取，具體操作按試劑盒說明書進行。取病毒培養(yǎng)液 150 μL，加入 RLT 裂解緩沖液 150 μL，β-巰基乙醇3 μL，充分混勻，冰盒靜置5 min；加入冷75%乙醇300 μL，混勻；RNA 提取試劑盒提取RNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HPIV-3 nest-RT-PCR 檢測 引物由蘭州生物制品研究所有限責任公司第二研究室自行設(shè)計及驗證。RT-PCR 上游引物 BPIS：5′-aaactcagacttggtacctgac-3′，下游引物 BPIA：5′-gaattgagtttaagcccttgtc-3′，產(chǎn)物長度510 bp。具體操作按one-step PrimeScript RTPCR kit 試劑說明書進行。RT-PCR 反應(yīng)體系：2 ×One Step Buffer 10 μL，PrimeScriptOne Step Enzyme Mix 0.4 μL，BPIS 0.4 μL，BPIA 0.4 μL，RNA 8.8 μL，共 20 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件：48 ℃ 30 min；94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。nest-PCR 上游引物 BPISn：5′-atcaactgtgttcgactccc-3′，下游引物 BPIAn：5′-accaaggactatgagatgcc-3′，產(chǎn)物長度 300 bp。具體操作按 Ex TaqE 試劑說明書進行。nest-PCR 反應(yīng)體系：10 × PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol ／ L）1.6 μL，BPISn（10 pmol ／ μL）0.4 μL，BPIAn（10 pmol ／ μL）0.4 μL，Ex TaqE 0.1 μL，RT-PCR 產(chǎn)物 2 μL，去離子水補至 20 μL。nest-PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃5 min。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.6 臨床標本的傳代培養(yǎng) 取出-80 ℃凍存的標本，室溫融化，渦旋振蕩2 min，吸入1.5 mL 離心管中，14 000 ×g離心 20 min；收集上清液，用針式濾器除菌過濾，接種至生長有WI-38 細胞的6 孔板中，37 ℃孵育2 h；棄上清，加入3 mL DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d；孔對孔連續(xù)傳代10次，進行RT-PCR 檢測。取HPIV-3 呈陽性的培養(yǎng)孔，進行滴度測定，將陽性、高滴度病毒株繼續(xù)進行噬斑克隆。

1.7 HPIV-3 陽性培養(yǎng)物的噬斑克隆純化 將10 次連續(xù)傳代培養(yǎng)的HPIV-3 陽性培養(yǎng)上清液進行10 倍系列稀釋（10-1~ 10-8倍），分別接種至生長MA104、WI-38 和 Vero 細胞的 6 孔板上，10-3~ 10-8每個稀釋度接種 1 孔，1 mL ／ 孔，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；棄上清液，加入用DMEM 配制的0.8%低熔點瓊脂糖，3 mL ／ 孔，室溫凝固后，倒置于 37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d；加入用含中性紅的DMEM 配制的1%低熔點瓊脂糖，室溫凝固，倒置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；盡量在高稀釋度孔中挑取蝕斑，接種至24 孔板同種細胞上，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 d。RT-PCR 法檢測HPIV-3 陽性克隆培養(yǎng)物，重復(fù)克隆5 次。挑取噬斑克隆滴度最高的克隆毒株進行外源因子檢測。

1.8 克隆毒株的外源因子檢測 用巢式RT-PCR 法檢測純化后克隆毒株中的鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、H1N1 甲型流感病毒、H2N3 甲型流感病毒、乙型流感病毒和支原體。檢測引物由蘭州生物制品研究所有限責任公司第二研究室自行設(shè)計，引物序列見表1，并通過陽性培養(yǎng)物驗證。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 外源因子檢測用引物序列Tab.1 Sequences of primers for detection of adventitious agents

1.9 支原體的去除及病毒穩(wěn)定性檢測 將高滴度克隆純化的HPIV3LZ1728C19 病毒株以0.05 MOI 接種至 Vero 細胞上，用含 10 μg ／mL Plasmocin 的MEM培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。每代取病毒培養(yǎng)液提取RNA，TaqMan 探針Real-Time RT-PCR法測定病毒滴度；提取病毒培養(yǎng)液DNA，巢式PCR法測定病毒培養(yǎng)液支原體（引物序列同1.8 項）。以相同的MOI 傳代直至支原體檢測陰性。同時每5代測定病毒HN和F基因核苷酸序列，比較其氨基酸的同源性。

1.10 最適宿主細胞的確定 WI-38、MA104 和Vero細胞計數(shù)：用含EDTA 的2.5%胰酶消化Vero 和MA104 細胞1 ~ 2 min，用含5% ~ 10%胎牛血清的MEM 和RPMI1640 培養(yǎng)液吹打分散；用不含EDTA的2.5%胰酶消化WI-38 細胞20 ~ 30 s，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液吹打分散。用Casy 細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞濃度，計算總細胞數(shù)。HPIV3LZ1728-C19 接種：按照0.05 MOI 分別接種至100%鋪滿WI-38、MA104 和 Vero 細胞的 T25 細胞瓶內(nèi)，37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；棄上清液，每瓶加入10 mL細胞培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天倒置顯微鏡下觀察細胞病變，并取樣，采用TaqMan探針Real-Time RT-PCR 法檢測病毒滴度，繪制病毒增殖曲線，直至90%細胞病變脫落。

1.11 HPIV-3 病毒培養(yǎng)液的大量制備 將克隆純化去除特定外源因子的HPIV3LZ1728C19 以0.05 MOI接種二層 WI-38 細胞工廠，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，收集上清液，TaqMan 探針Real-Time RT-PCR法檢測病毒滴度，-80 ℃凍存。

1.12 HPIV-3 病毒滴度測定 采用TaqMan 探針Realtime RT-PCR 法。引物由蘭州物制品研究所有限責任公司第二研究室自行設(shè)計，引物（HNRealS／HNRealA）和探針（HNProbe）（序列未公布）位于HPIV-3 的HN基因上。使用Primer 5 設(shè)計引物，Primer Ex-press 3.0驗證引物 ／ 探針退火溫度，Blast 驗證引物特異性。用one-step PrimeScript RT-PCR Ki（tRR064A）完成。RT-PCR 反應(yīng)體系：2 × one step RT-PCR bufferⅢ10 μL，TaKaRa Ex TaqHS（5U ／ μL）0.4 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4 μL，HNRealS（10 pmol ／ μL）0.6 μL，HNRealA（10 pmol ／ μL）0.6 μL，HNProbe（10 pmol ／ μL）0.2 μL，ROX Reference Dye（50 ×）0.4 μL，RNase free H2O 5.4 μL，RNA 2 μL。RNA標準品為4.7 × 100～ 4.7 × 107copies ／μL 的體外轉(zhuǎn)錄HPIV-3 HN RNA。RT-PCR 反應(yīng)條件：Stage 1 Reverse transcription Reps，42 ℃ 5 min；Stage 2，95 ℃10 s；Stage 3 PCR Reps：40 times，95 ℃ 5 s，57 ℃34 s，57 ℃進行熒光信號采集。

1.13 HPIV-3 病毒超速離心純化 將HPIV3LZ172 8C19 病毒培養(yǎng)液于 4 ℃，11 000 ×g離心 30 min；沉淀細胞碎片，收集上清液，取50 mL 加至70 mL 專用離心管中，用8 cm 長針頭從底部輕輕推入20 mL 50%蔗糖（保持界面清晰），4 ℃，140 000 ×g超速離心4 h；棄上清液，用無菌TNE Buffer 重懸沉淀，電子顯微鏡下觀察病毒形態(tài)（由蘭州大學電鏡中心完成）。

1.14 HPIV3LZ1728C19 病毒外殼蛋白的鑒定 將超速離心純化的HPIV3LZ1728C19 病毒蛋白進行12% SDS-PAGE 分析。將凝膠按照標準程序［12］進行Western blot 分析。一抗為兔抗重組HPIV-3HN蛋白多克隆抗體和兔抗重組F 蛋白多克隆抗體（均1 ∶500 稀釋），二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔 IgG（1 ∶1 000 稀釋）。用 Lumi-Light Western blotting substrate 顯色，凝膠成像儀成像。

1.15 HPIV3LZ1728C19 病毒感染細胞的免疫熒光鑒定 將HPIV3LZ1728C19 病毒以0.05 MOI 感染96 孔板 Vero 及 MA104 細胞，37 ℃，5%CO2培養(yǎng) 48 h；棄上清，加入 80%丙酮，100 μL ／ 孔，室溫 15 min；吸出丙酮，室溫干燥 2 h；加入去離子水，100 μL ／ 孔，室溫10 min；去除去離子水，拍干細胞板，加入羊抗HPIV-3 全病毒抗體（1 ∶200 稀釋），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育1 h；棄上清，PBST 洗板，加入FITC 標記的兔抗羊 IgG（1 ∶500 稀釋），37 ℃孵育 1 h；棄上清，PBST洗板，加入60%甘油，熒光顯微鏡下觀察感染細胞。

1.16 HPIV3LZ1728C19 毒株全基因組核苷酸序列測定 采用二代基因測序法，由上海伯杰醫(yī)療科技有限公司完成。

1.17 HPIV3LZ1728C19 毒株基因序列進化分析和進化樹繪制 進化樹應(yīng)用NCBI Blast 程序在線完成。傳代培養(yǎng)病毒HN、F 蛋白氨基酸同源性比對用La-sergene 軟件的MegAlign 模塊完成。

2 結(jié) 果

2.1 臨床標本中HPIV-3 陽性率 臨床標本接種WI-38 細胞培養(yǎng) 7 d，RT-PCR（一次 PCR）檢測陽性率為 1.45%（73 ／ 5 037），nest-PCR 檢測陽性率為18%（906 ／ 5 037）。將 73 份 RT-PCR 檢測陽性標本經(jīng)10 次細胞傳代培養(yǎng)后，僅2 份標本為HPIV-3陽性（2 ／ 5037），表明 HPIV-3 感染普遍存在，但能夠長期體外傳代存活的高滴度病毒株非常稀少。2 份HPIV-3 陽性標本，其中1 株病毒滴度為4.7 ×107copies／mL，命名為HPIV3LZ1728，進行后續(xù)研究。

2.2 HPIV3LZ1728 的噬斑克隆純化結(jié)果 10 次細胞傳代培養(yǎng)的HPIV3LZ1728 在MA104 和Vero 細胞上均有蝕斑形成，見圖1；在WI-38 細胞上無噬斑形成。挑取滴度最高的1 個克隆毒株進行外源因子檢測。

圖1 HPIV3LZ1728C19 在Vero 和MA104 細胞上的噬斑結(jié)果Fig.1 Plaques formed by HPIV3LZ1728C19 on Vero and MA104 cells

2.3 克隆毒株的外源因子檢測結(jié)果 克隆株除支原體外，其余6 種外源因子檢測結(jié)果均為陰性，見圖2。

圖2 HPIV3LZ1728C19 分離株外源因子檢測結(jié)果Fig.2 Test for adventitious agents in HPIV3LZ1728C19 isolate

2.4 克隆毒株的去支原體傳代結(jié)果 隨著去支原體傳代培養(yǎng)，克隆毒株培養(yǎng)液的支原體PCR 擴增條帶逐漸變?nèi)酰敝?3 代去支原體培養(yǎng)，HPIV3LZ17-28C19 分離株支原體檢測為陰性。

2.5 克隆毒株傳代的增殖穩(wěn)定性和遺傳穩(wěn)定性HPIV-3 病毒滴度檢測結(jié)果顯示，HPIV3LZ1728C19克隆株在傳代過程中，滴度均無顯著變化，1 mL 滴度值在7.5 ~ 8.5 之間，見圖3。氨基酸同源性比對結(jié)果顯示，經(jīng)過25 代傳代培養(yǎng)，F(xiàn) 蛋白氨基酸同源性高于99.4%，HN 蛋白氨基酸同源性高于99.5%，見圖4，表明HPIV3LZ1728C19 毒株在有限傳代過程中具有遺傳和增殖穩(wěn)定性。

圖3 HPIV3LZ1728C19 分離株在Vero 細胞傳代過程中的病毒滴度測定Fig.3 Determination of titer of HPIV3LZ1728C19 isolate during subculture in Vero cells

圖4 HPIV3LZ1728C19 分離株在Vero 細胞傳代過程中的 F（A）和 HN 蛋白（B）氨基酸同源性Fig.4 Homologies of amino acids of F（A）and HN（B）proteins of HPIV3LZ1728C19 isolate during subculture in Vero cells

2.6 HPIV3LZ1728C19 最適宿主細胞及增殖曲線病毒滴度檢測結(jié)果顯示，病毒在3 種細胞上均可產(chǎn)生明顯病變，并高滴度增殖，在MA104 細胞上滴度最高，可達 109copies ／ mL；在 WI-38 和 Vero 細胞上滴度相似，可達 107~ 108copies ／ mL。見圖 5 和圖 6。

圖5 HPIV3LZ1728C19 在3 種宿主細胞上的病變情況（× 100）Fig.5 CPE of HPIV3LZ1728C19 isolate on WI-38，Vero and MA104 cells（× 100）

圖6 HPIV3LZ1728C19 在3 種宿主細胞中的增殖曲線Fig.6 Proliferation curves of HPIV3LZ1728C19 on WI-38，Vero and MA104 cells

2.7 純化HPIV-3 病毒培養(yǎng)液的電鏡觀察 電鏡下可見長軸徑150 ~ 300 nm 的病毒顆粒，且在病毒的外周可見清晰的脂質(zhì)外膜，見圖7。

圖7 HPIV3LZ1728C19 的電鏡圖譜Fig.7 Electron micrograph of HPIV3LZ1728C19

2.8 HPIV3LZ1728C19 病毒外殼蛋白的鑒定結(jié)果12% SDS-PAGE 分析顯示，在磷酸蛋白（PP）、血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）、融合蛋白（F0）、核蛋白（NP）、Furin 酶切融合蛋白（F1）、基質(zhì)蛋白（M）的預(yù)測相對分子質(zhì)量大小處均可見清晰的染色條帶。Western blot 分析顯示，超速離心純化病毒與重組HPIV-3HN蛋白抗體在預(yù)期的相對分子質(zhì)量（64 000）處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶；與重組F 蛋白抗體在預(yù)期的相對分子質(zhì)量（60 000）處出現(xiàn)較弱的F0 條帶，同時在相對分子質(zhì)量約50 000 處也出現(xiàn)了更強的反應(yīng)條帶，這與F0 蛋白的Furin 酶切產(chǎn)物F1 的相對分子質(zhì)量大小一致。表明HPIV3LZ1728C19 毒株具有HPIV-3的HN 和F 蛋白。見圖8。

圖8 純化HPIV3LZ1728C19 的 SDS-PAGE（A）和 Western blot（B）分析Fig.8 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）profiles of purified HPIV3LZ1728C19

2.9 感染細胞的熒光顯微鏡觀察 HPIV3LZ1728-C19 感染的兩種細胞的細胞膜處均有強烈的熒光染色，見圖9，表明在Vero 和MA104 細胞中高滴度復(fù)制的病毒為HPIV-3。

圖9 HPIV3LZ1728C19 感染細胞的免疫熒光顯微鏡觀察（× 100）Fig.9 IFA of cells infected with HPIV3LZ1728C19（× 100）

2.10 HPIV3LZ1728C19 分離株全基因組結(jié)構(gòu)特征及進化分析 二代基因測序結(jié)果表明，HPIV3LZ-1728C19 株全長基因組含有15 462 個核苷酸。全基因組核苷酸序列比對結(jié)果顯示，HPIV3LZ1728C19全基因序列與GenBank 上登錄的HPIV-3 株HPIV3 ／VietNam ／ 094 ／ 2010（MH006672.1）同源性最高為99.14%，其次與 HPIV3 ／ MEX ／ 2545 ／ 2006（No.KF-530250）同源性為99.08%。表明HPIV3LZ1728C19毒株的基因組具有HPIV-3 的遺傳特征。進化樹分析顯示，HPIV-3 進化的起源均位于亞洲（MN145875 ／杭州、MH006672 ／ 越南和 HPIV3LZ1728C19）。HPIV3LZ1728C19 處于單獨的進化分支，且位于進化分支的上游。其下游的進化病毒株遍布美洲、歐洲和亞洲。見圖10。HPIV3LZ1728C19 基因組序列已登錄GenBank，收錄號為：MT374082。核苷酸序列分析可知，該HPIV3LZ1728C19 株符合副黏病毒科基因組“6 堿基原則”，按照 5′-NP（111-1658）-PP ／ C（1784-3565）-M（3753-4814）-F（5072-6691）-HN（6806-8524）-L（8571-15347）-3′的順序編碼 6 種蛋白，基因結(jié)構(gòu)與已知序列HPIV-3 分離株相同。氨基酸序列分析顯示，HPIV3LZ1728C19 各編碼區(qū)具有以下特征：NP基因編碼1 個516 aa 的蛋白，含有323F-X4-Y-X4-SYAMG337副黏病毒NP 蛋白特征序列；PP基因編碼1 個600 aa的蛋白；M基因編碼1 個 354 aa 的pI9.58 的堿性蛋白。F基因編碼1 個540 aa 的蛋白，肽鏈上有1個106RTKR109Furin 酶切位點，359NRSQ362、446NNSV449、508NITI512三個糖基化位點，以及490SSTTIIVILIMMIILFIINITIITIAIK517跨膜區(qū)域；HN基因編碼 1 個 573 aa的蛋白，有252NRKCSC257唾液酸位點，308NISP311和485NPTG488兩個糖基化位點；L基因編碼 1 個 2 259 aa 的蛋白，有 1 個797GDNQ800RNA 聚合酶活性位點，1 個1811K-X21-G-E-G-A-G1837ATP 結(jié)合位點。見表2。HPIV3LZ1728C19 毒株的這些蛋白特征區(qū)域均與其他HPIV-3 病毒分離株相同。表明HPIV3LZ1728C19 病毒株是HPIV-3。

圖10 HPIV3LZ1728C19 全基因組遺傳進化分析Fig.10 Phylogenetic analysis of whole genome of HPIV3LZ1728C19

表2 HPIV3LZ1728C19 各編碼區(qū)的位置、氨基酸數(shù)量以及編碼特征結(jié)構(gòu)區(qū)域Tab.2 Location，number of amino acids and encoded characteristic domains of encoding regions of HPIV3LZ1728C19

3 討 論

為了從臨床標本中分離1 株可以在體外長期傳代的高滴度HPIV-3 野毒株，2005—2017 年間，每年第4 季度至次年第1 季度，蘭州生物制品研究所有限責任公司委托甘肅省婦幼保健醫(yī)院和甘肅省疾病預(yù)防控制中心收取下呼吸道感染住院患兒下呼吸道分泌物標本，共計5 037 份。所有標本均接種WI-38 細胞，37 ℃培養(yǎng) 7 d，用 nest-RT-PCR 檢測培養(yǎng)上清HPIV-3 RNA，結(jié)果顯示，RT-PCR 檢測陽性率為1.45%（73 ／ 5 037），nest-PCR 檢測陽性率為 18%。表明在甘肅下呼吸道感染住院患兒中HPIV-3 感染非常普遍，且本研究結(jié)果顯著高于許多報道［2，13］，可能是我們將所有樣本進行了WI-38 細胞培養(yǎng)，從而使HPIV-3 檢出率明顯增加。為了進行后續(xù)HPIV-3野毒株的分離，將RT-PCR 陽性標本在WI-38 細胞上連續(xù)傳代10 次，HPIV-3 陽性培養(yǎng)物僅剩下2 個。表明雖然HPIV-3 感染非常普遍，但能夠長期體外傳代培養(yǎng)的病毒株非常稀少。我們將其中最高滴度的病毒進行噬斑克隆純化并去除支原體，獲得1 株可在體外長期傳代的高滴度的無特定外源因子的HPIV-3 野毒株，并命名為HPIV3LZ1728C19。

對于HPIV-3 的分離，常用的細胞基質(zhì)有人胚肺成纖維細胞、人喉癌細胞（Hep-2）、Vero 細胞、Madin-Darby 犬腎細胞、人黑色素瘤細胞（HMV-Ⅱ）、恒河猴腎細胞等［14］。為了后續(xù)疫苗的研發(fā)，我們選取了WHO許可的人用疫苗細胞基質(zhì)WI-38 和Vero 細胞［15］，進行了陽性標本的篩選和分離，結(jié)果顯示，HPIV3LZ-1728C19 感染的WI-38 和Vero 細胞，均可產(chǎn)生顯著的細胞病變，并且高度增殖，滴度可達1×107copies／mL以上；在Vero 細胞上可形成清晰的噬斑，但在WI-38 細胞上無噬斑出現(xiàn)，這可能與細胞的形態(tài)有關(guān)。WI-38 細胞是細長的梭狀不規(guī)則形態(tài)，而Vero 細胞則為相對規(guī)則均一的橘子瓣形態(tài)，有利于噬斑形成。由于細胞表面含有唾液酸受體，MA104 細胞常用于輪狀病毒的分離培養(yǎng)［16］。此細胞具有生長速度快、可連續(xù)傳代、易于規(guī)?；囵B(yǎng)等優(yōu)點。本研究將HPIV3LZ1728C19 在MA104 細胞上進行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)病毒感染MA104 細胞也可形成明顯病變和噬斑，且培養(yǎng)液病毒滴度較在WI-38 和Vero 細胞培養(yǎng)中高2個lg 滴度值，雖然MA104 細胞不是人用疫苗的許可細胞基質(zhì)，但HPIV3LZ1728C19 可在其中高度增殖并形成噬斑，可用其制備非疫苗用抗原以及建立中和抗體檢測方法。后續(xù)的研究還表明，HPIV3LZ-1728C19 可感染 BALB ／ c 小鼠，在小鼠的上下呼吸道顯著增殖，造成小鼠肺部的炎癥性病理變化，并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的細胞和體液免疫應(yīng)答（未發(fā)表），以此我們成功地用HPIV3LZ1728C19 病毒株建立了HPIV-3 感染小鼠動物模型，可用于HPIV-3 疫苗保護效力的評價。

HPIV-3 屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬，是一種具有脂膜的單股負鏈RNA 病毒，基因組全長約15 400 核苷酸，編碼 6 個蛋白［17］。核苷酸測序結(jié)果顯示，HPIV3LZ1728C19 全基因組含有15 462 個核苷酸，與GenBank 上登錄的HPIV-3 基因組同源性最高達到99.14%。序列分析顯示，基因組編碼6種蛋白，基因結(jié)構(gòu)與已知序列HPIV-3 分離株相同，且編碼的6 個蛋白均含有HPIV-3 各蛋白的特征功能結(jié)構(gòu)域。表明HPIV3LZ1728C19 具有HPIV-3 的遺傳特征。

用HPIV-3 全病毒抗體對HPIV3LZ1728C19 感染細胞進行了免疫熒光染色，結(jié)果顯示，感染細胞的細胞膜處出現(xiàn)了強烈的熒光信號，表明HPIV3LZ17-28C19 是HPIV-3。蔗糖密度超速離心純化的HPIV-3LZ1728C19，在電鏡下觀察到了病毒顆粒，其形態(tài)和大小與文獻報道一致［17］。純化病毒的SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在預(yù)期的 NP（57 800）、PP（67 200）、M（39 500）和HN（64 100）蛋白相對分子質(zhì)量處，出現(xiàn)了清晰的染色條帶，而在F 蛋白相對分子質(zhì)量（59 900）處，僅有微弱的染色條帶，但在F 蛋白的Furin 酶切產(chǎn)物F1 相對分子質(zhì)量（50 000）處，有清晰的染色條帶，在L 蛋白預(yù)期相對分子質(zhì)量（259 000）處無明顯的染色條帶，可能是由于L 蛋白太大，在常規(guī)膠濃度（12%）下，蛋白不能進入分離膠。HN 和F 蛋白特異性抗體Western blot 分析結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量64 000 處有強烈的HN 蛋白反應(yīng)條帶，在相對分子質(zhì)量50 000 處有強烈的F1 蛋白反應(yīng)條帶，在相對分子質(zhì)量59 900 處僅有輕微的F 蛋白反應(yīng)條帶，證明 HPIV3LZ1728C19 含有 HPIV-3 的 HN 和 F 蛋白，且F 蛋白上有Furin 酶切位點。HN 和F 是HPIV-3的主要的結(jié)構(gòu)蛋白和中和抗原，與病毒對宿主細胞的感染相關(guān)［17-18］。在HPIV-3 感染細胞的過程中，HN蛋白與宿主細胞的唾液酸受體結(jié)合，F(xiàn) 蛋白被Furin酶切激活后，以由二硫鍵結(jié)合的F1（49 900）和F2（10 000）肽鏈亞穩(wěn)態(tài)融合前形式存在，并進行一系列的結(jié)構(gòu)重排形成穩(wěn)定的融合后形式，促進病毒脂膜和細胞膜之間的融合［19］。Western blot 分析結(jié)果表明HPIV3LZ1728C19 F 蛋白主要以酶切后F1 的形態(tài)存在，這也許就是此株病毒在3 種宿主細胞中可以高滴度增殖的原因。

綜上所述，本研究分離純化了1 株可以在體外傳代的高滴度的HPIV-3 野毒分離株HPIV3LZ172-8C19，并對其遺傳特性和細胞培養(yǎng)特性進行了鑒定。HPIV3LZ1728C19 毒株為HPIV-3 疫苗的研發(fā)以及HPIV-3 感染動物模型和中和抗體滴度檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。