香菊片質(zhì)量控制研究

李 春，賈文江，李 宏，劉 崢

（陜西省商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000）

香菊片由化香樹果序（除去種子）、夏枯草、野菊花、黃芪、辛夷、防風(fēng)、白芷、甘草、川芎9味中藥提取制成，功能辛散祛風(fēng)、清熱通竅，用于治療急、慢性鼻竇炎和慢性鼻炎。目前香菊片已收錄的標(biāo)準(zhǔn)只有黃芪中主要成分黃芪甲苷的含量測定，但不能全面、準(zhǔn)確地評價產(chǎn)品質(zhì)量［1］。中藥指紋圖譜運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)以圖形的形式表達(dá)中藥化學(xué)信息，具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，全面呈現(xiàn)了中藥各成分間的相互作用，高效、準(zhǔn)確、全面［2］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定香菊片中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨9種主要功效成分的含量，并建立了香菊片指紋圖譜共有模式，對其共有峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬確定?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Sartorius SQP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為0.1 mg）；KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；RS30UVE型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831－201605，含量以90.8%計），咖啡酸對照品（批號為110885－201703，含量以99.7%計），綠原酸對照品（批號為110753－201817，含量以96.8%計），升麻素苷對照品（批號為111523－201712，含量以97.4%計），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920－201606，含量以97.6%計），5－O－甲基維斯阿米醇苷對照品（批號為111523－201811，含量以97.4%計），迷迭香酸對照品（批號為111871－201706，含量以90.5%計），蒙花苷對照品（批號為111528－201710，含量以96.6%計），甘草酸銨對照品（批號為111731－201720，含量以97.7%計），辛夷對照藥材（批號為121079－201205），防風(fēng)對照藥材（批號為120947－201810），夏枯草對照藥材（批號為120993－201306），黃芪對照藥材（批號為121462－201705），均購于中國食品藥品檢定研究院；化香樹果序?qū)φ账幉模◤V元市黎生中藥材專業(yè)合作社，批號為Z190801），香菊片（批號分別為181003，191110，191201，191203，191204，191208，191209，規(guī)格為每片0.32 g），均購自陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲醇、磷酸（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3－7］

色譜柱：Kromasill00－5－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

2.2 溶液制備

取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為23.154 0，16.262 4，11.964 0，11.882 8，16.396 8，11.103 6，19.005 0，27.434 0，23.448 0μg/mL的混合對照品溶液。取7批樣品，各20片，除去包衣，研細(xì)，取粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）45 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取對照藥材化香樹果序、辛夷、防風(fēng)、夏枯草、黃芪，按制備工藝煎煮2次，合并煎液，濃縮至干，加60%乙醇30 mL，過濾，低溫蒸干，用甲醇5 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液作為對照藥材溶液。取除化香樹果序（除去種子）、辛夷、防風(fēng)、夏枯草、黃芪及其他藥材，按香菊片處方工藝制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.3 指紋圖譜建立及分析

2.3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號為191208）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果以迷迭香酸色譜峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.73%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于1.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為191208）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果以迷迭香酸色譜峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.51%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于1.44%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為191208）樣品，依法制備供試品溶液，共6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果以迷迭香酸色譜峰為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.82%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于1.52%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

2.3.2 指紋圖譜建立及相似度評價

取6批樣品（編號為S1－S6），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。詳見圖1。將6份指紋圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）軟件，采用中位數(shù)法，設(shè)定時間窗口為0.1，經(jīng)多點(diǎn)校正，生成指紋圖譜共有模式，共得到18個共有峰。詳見圖2。以6批樣品生成的指紋圖譜共有模式為對照圖譜，計算各譜圖與共有模式的相似度。結(jié)果6批指紋圖譜的相似度分別為0.965，0.973，0.976，0.964，0.969，0.977。

圖1 樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprints of the sample

圖2 高效液相色譜指紋圖譜共有模式Fig.2 The common pattern of HPLC fingerprints

2.3.3 共有峰指認(rèn)與歸屬

取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液和對照藥材溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并與指紋圖譜共有模式中各主要共有峰進(jìn)行對比。以保留時間為評價指標(biāo)，指認(rèn)出指紋圖譜共有模式中3，4，5，7，8，10，11，13，14號特征峰分別為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨；與同樣條件下測得的對照藥材的指紋圖譜進(jìn)行比較，確認(rèn)1，2，3號峰來源于化香樹果序，5，11號峰來源于夏枯草，7，9，10號峰來源于防風(fēng)，8號峰來源于黃芪，4，6，12，15，16，17，18號峰來源于辛夷。詳見圖3。

圖3 指紋圖譜疊加圖Fig.3 Superimposed fingerprints

2.4 含量測定

2.4.1 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖4）。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，理論板數(shù)按迷迭香酸峰（11號峰）計均大于3 000。

線性關(guān)系考察及檢測限（LOD）和定量限（LOQ）確定：精密吸取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為154.360 0，65.050 0，11.964 0，11.882 8，81.984 0，11.103 6，19.005 0，27.434 0，234.480 0μg/mL的混合對照品溶液1，2，5，10，15，20 mL，分別置20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以各組分對照品質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液，用甲醇逐步稀釋，按各組分色譜峰信噪比（S/N）分別為3∶1和10∶1時測定LOD和LOQ。結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為191208）樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為191208）樣品，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號為191208）1 g，精密稱定，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密加入沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨對照品適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算各成分平均加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 香菊片中9種成分含量測定方法學(xué)考察結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of the methodological investigations of the content determination of the content determination of nine components in Xiangju Tablets（n＝6）

1.沒食子酸 2.綠原酸 3.咖啡酸 4.升麻素苷 5.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 6.5－O－甲基維斯阿米醇苷 7.迷迭香酸 8.蒙花苷 9.甘草酸銨A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照藥材溶液圖4 高效液相色譜圖1.gallic acid 2.chlorogenic acid 3.caffeic acid 4.prim－O－glucosylcimifugin 5.calycosin－7－O－glucoside 6.5－O－methylvisammioside 7.rosmarinic acid 8.buddleoside 9.ammonium glycyrrhetateA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference medicinal materials solutionFig.4 HPLC chromatograms

2.4.2 樣品含量測定

取7批香菊片樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定3次，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計算各成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 香菊片中9種成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.3 Determination results of nine components in Xiangju Tablets（mg/g，n＝3）

3 討論

考察了不同提取方法（超聲提取和加熱回流提?。?，不同提取時間（30，45，60 min），不同流速（0.6，0.8，1.0 mL/min），不同柱溫（25，30，35，40℃），不同進(jìn)樣量（5，10，20μL），不同流動相體系（甲醇、乙腈、不同比例磷酸水溶液），不同檢測波長（190～400 nm）對含量測定結(jié)果的影響。綜合色譜峰基線平穩(wěn)，保留時間適中，峰形及峰分離情況，最終選擇2.1項(xiàng)下色譜條件。

本研究中測定了6批香菊片的指紋圖譜，并采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）建立了指紋圖譜的共有模式，相似度比較結(jié)果顯示，不同批次香菊片的差異較小，表明其質(zhì)量較穩(wěn)定。采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正，自動匹配生成了18個共有峰，指認(rèn)其中的9個指標(biāo)成分，分別為沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、迷迭香酸、蒙花苷、甘草酸銨?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，上述9種成分主要具有抗炎、抗過敏的藥理學(xué)作用，與香菊片的藥效相關(guān)，能較好地反映產(chǎn)品質(zhì)量［8－11］。

綜上所述，建立的方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，可用于香菊片的質(zhì)量控制，可為其選料、生產(chǎn)、儲存、檢驗(yàn)等過程的質(zhì)量控制提供參考。