在渝流通雙黃連口服液質(zhì)量分析

余 為

（重慶市黔江食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 409000）

雙黃連口服液由金銀花（雙花）、黃芩、連翹經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒等功效，主要用于治療外感風(fēng)熱所致感冒、甲型H1N1流感、重癥急性呼吸綜合征、流行性腮腺炎、口腔潰瘍等［1－5］。2020年起，雙黃連因被發(fā)現(xiàn)口服后可通過多靶點(diǎn)、多通路抑制新型冠狀病毒［6－8］而熱銷。本研究中對35批在渝流通雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸、連翹苷3個指標(biāo)性成分進(jìn)行檢測，以為臨床應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；XP205型分析天平（美國Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；SB－800DT型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號為110715－201318，含量為93.3%），綠原酸對照品（批號為110753－201415，含量為96.2%），連翹苷對照品（批號為110821－201615，含量為94.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；冰醋酸、中性氧化鋁均為分析純；水為超純水。35批雙黃連口服液（見表1）均為2017年起就在重慶流通且送監(jiān)督抽檢的產(chǎn)品，被抽檢單位主要來自重慶轄區(qū)的醫(yī)院、診所、藥品批發(fā)公司、連鎖藥店、個體藥店等。

表1 35份雙黃連口服液樣品信息Tabl.1 Information of 35 samples of Shuanghuanglian Oral Liquid

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SR－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：黃芩為甲醇－水－冰醋酸（50∶50∶1，V/V/V），金銀花為甲醇－水－冰醋酸（20∶80∶1，V/V/V），連翹為乙腈－水（25∶75，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：黃芩為274 nm，金銀花為324 nm，連翹為278nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：黃芩為5μL，金銀花、連翹均為10μL。

2.1.2 溶液制備

黃芩：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的黃芩苷對照品溶液。精密量取樣品1 mL，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋，超聲（功率800 W，頻率40 kHz）處理20 min，放至室溫，用50%甲醇定容，即得黃芩供試品溶液。按雙黃連口服液工藝及處方制備缺黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

金銀花：取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加水溶解，制成質(zhì)量濃度為40μg/mL的綠原酸對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加水定容，搖勻，即得金銀花供試品溶液。按雙黃連口服液工藝及處方制備缺金銀花的陰性樣品，并按供試品制備方法制備陰性對照品溶液。

連翹：取連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇，制成質(zhì)量濃度為60μg/mL的連翹苷對照品溶液。精密量取樣品1 mL，過中性氧化鋁柱（100～120目，6 g，內(nèi)徑為1 cm），用70%乙醇40 mL洗脫，然后濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，再用50%甲醇定容，搖勻，即得連翹供試品溶液。按雙黃連口服液工藝及處方制備缺連翹的陰性樣品，并按供試品制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.1.2項(xiàng)下3種對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果各測定組分能與相鄰組分完全分離，理論板數(shù)均大于5 000。色譜圖見圖1。

1.黃芩苷 2.綠原酸 3.連翹苷A，D，G.對照品溶液（分別為黃芩苷、綠原酸、連翹苷） B，E，H.供試品溶液C，F(xiàn)，I.陰性對照品溶液（分別缺黃芩、金銀花、連翹）圖1 高效液相色譜圖1.baicalin 2.chlorogenic acid 3.forsythinA.D，G.Reference solution（baicalin，chlorogenic acid and forsythin respectively）B.E，H.Test solution C.F，I.Negative reference solution（without Scutellariae Radix，Lonicerae Japonicae Flos and Forsythiae Fructus respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項(xiàng)下3種對照品溶液各2，5，10，15，20μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以各對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，黃芩苷為Y1＝6.033 4X1＋56.51，r＝0.999 1（n＝5）；綠原酸為Y2＝35.095X2－120.83，r＝0.999 5（n＝5）；連翹苷為Y3＝5.882 6X3＋42.476，r＝0.999 8（n＝5）。結(jié)果表明，黃芩苷、綠原酸、連翹苷質(zhì)量濃度分別在40.77～407.68μg/mL、8.70～87.02μg/mL、12.65～126.48μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下各對照品溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果黃芩、金銀花、連翹峰面積的RSD分別為0.35%，0.21%，0.40%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號為16112611）適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，10，12，24 h時按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果黃芩、金銀花、連翹峰面積的RSD分別為0.93%，0.86%，1.02%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為16112611）適量，共6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果黃芩、金銀花、連翹含量的RSD分別為1.57%，1.33%，1.86%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號為16112611），共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度對照品溶液，依法制備供試品溶液，并按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n＝6）

2.1.4 樣品含量測定

取35批樣品各適量，依法制備供試品溶液，再按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表3。3個指標(biāo)性成分的含量均高于2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，說明2017年起在渝流通雙黃連口服液質(zhì)量較好。產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量差異較大，同一廠家、不同批號含量高低值相差也較大。詳見表4。

表3 不同廠家樣品指標(biāo)性成分含量、相對密度及pH（n＝3）Tab.3 The content，relative density and pH of index components in the samples from different manufacturers（n＝3）

表4 相同廠家不同批號樣品指標(biāo)性成分含量、相對密度及pHTab.4 The content，relative density and pH of index components in different batches of samples from the same manufacturer

2.2 相對密度及pH

參照2020年版《中國藥典（一部）》中方法檢測，結(jié)果35份樣品的相對密度為1.13～1.16，pH為5.30～6.19，均較穩(wěn)定。詳見表4。

2.3 樣品聚類分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對35批樣品進(jìn)行聚類分析［9］，以各有效成分作為指標(biāo)。結(jié)果可將樣品聚為三類。其中，編號4，7，10－16，18－21，23，25，32，34樣品聚為一類；編號1－3，5，9，17，24，26－30，33，35聚為一類；編號6，8，22，31聚為一類。詳見圖2。需注意，哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司及河南福森藥業(yè)有限公司均有相同批號的2份樣品分別聚在不同類，表明即使同一廠家相同批次的樣品，內(nèi)在質(zhì)量依然存在較大差異。

圖2 聚類分析結(jié)果Fig.2 Results of cluster analysis

3 討論

程敏等［10］發(fā)現(xiàn)，山銀花提取物偽品或摻偽品中綠原酸含量相對較高。2020年版《中國藥典（一部）》規(guī)定綠原酸含量為0.60 mg/mL，35批樣品中綠原酸含量最高達(dá)1.60 mg/mL，是否直接添加了某提取物有待考證，應(yīng)考慮廠家是否按藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）要求生產(chǎn)，是否本著節(jié)約成本的原則核算金銀花投料，可參照山銀花特征圖譜灰氈毛忍冬皂苷乙、指紋圖譜進(jìn)行考察［11］。研究表明，產(chǎn)地、采收季節(jié)及烘干方式均影響連翹苷的含量。如王琳等［12］等發(fā)現(xiàn)，連翹質(zhì)量以河北產(chǎn)最優(yōu)，其次為山西產(chǎn)，再次為河南產(chǎn)；青翹優(yōu)于老翹；6月采收最優(yōu)；采后汽蒸烘干處理較自然晾曬能更好地保存藥用成分。劉廷等［13］采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雙黃連口服液中6個酚酸類成分、3個苯乙醇苷類成分、8個黃酮類成分，故認(rèn)為找出提取物特征圖譜與原藥材差異有利于從源頭控制成藥質(zhì)量。

雙黃連口服液臨床應(yīng)用較廣，其功效的發(fā)揮與其內(nèi)在質(zhì)量緊密相關(guān)，綠原酸新批次含量幾乎均高于舊批次，原因可能由于綠原酸為苯丙酸類，分子結(jié)構(gòu)有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩(wěn)定部分，在儲存中易水解等異構(gòu)化造成含量降低。查閱文獻(xiàn)［14－15］可知，不同的純化工藝、精制等環(huán)節(jié)的處理方法對綠原酸含量均有影響。為了提供質(zhì)優(yōu)、穩(wěn)定的雙黃連口服液，廠家需從黃芩、金銀花、連翹的源頭控制，嚴(yán)格執(zhí)行GMP生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)的質(zhì)量監(jiān)管，以更好提高其品質(zhì)。

綜上所述，本研究中以黃芩苷、綠原酸、連翹苷的含量作為指標(biāo)進(jìn)行檢測與分析，發(fā)現(xiàn)目前在渝流通雙黃連口服液質(zhì)量較好，但不同廠家、不同批號的雙黃連口服液含量差異較大，需從藥材源頭、生產(chǎn)、流通等各環(huán)節(jié)對質(zhì)量進(jìn)行把控，以提高雙黃連口服液質(zhì)量的一致性。