甜菜NADP-ME基因家族的生物信息學(xué)分析

李思琪，迪娜爾·葉爾蘭，周婉婷，汪曼，李佳佳，劉大麗，興旺，常廣玉

（1.國(guó)家甜菜種質(zhì)中期庫(kù)/黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院/黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3.穆棱市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江牡丹江 157500）

0 引言

蘋果酸參與多種代謝途徑，有幾種酶對(duì)其進(jìn)行代謝。其中一種重要的蘋果酸代謝酶是NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）。NADP-ME 是一類廣泛存在于原核和真核生物中參與生物體生命活動(dòng)中多種代謝過程的酶。NADP-ME 主要存在于葉綠體、線粒體和胞質(zhì)中，并通過二價(jià)金屬離子催化蘋果酸氧化脫羧，產(chǎn)生丙酮酸、CO2和NADPH。同時(shí)，產(chǎn)生的NADPH也可以作為其它合成反應(yīng)的還原劑[1]。

NADP-ME普遍存在于植物的不同組織中，因此被認(rèn)為具有不同的體內(nèi)調(diào)控功能。NADP-ME在植物的光合作用中發(fā)揮著重要作用，通過釋放二氧化碳以用于RuBisCo酶（加氧酶）的固碳，從而減弱植物的光呼吸作用，減少氧氣的消耗，使植物保持較高的光合效率[2]。除此之外，植物受傷或暴露于UV-B 輻射可誘導(dǎo)NADP-ME 的表達(dá)[3]。通過這種方式，該酶為木質(zhì)素生物合成中兩個(gè)NADPH 依賴的還原步驟提供NADPH，并參與木質(zhì)素相關(guān)的生物防御。另外，NADP-ME 也可為類黃酮生物合成途徑提供還原力。丙酮酸是NADP-ME 反應(yīng)的產(chǎn)物之一，它可在線粒體中通過呼吸作用獲得ATP，并可作為磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成的前體。PEP 促進(jìn)苯丙氨酸等芳香族氨基酸的合成，是木質(zhì)素和類黃酮合成的共同底物。此外，NADPME可參與活性氧的合成機(jī)制[4]，借以破壞病原體而產(chǎn)生。因此，NADP-ME水平的增加可為防御物質(zhì)的生物合成提供基礎(chǔ)和能量，這也進(jìn)一步說明蘋果酸代謝在植物逆境防御中發(fā)揮了重要作用。

根據(jù)光合作用中的碳同化途徑，植物分為C3、C3-C4、C4和CAM 四類[5]。根據(jù)功能和亞細(xì)胞定位的不同，植物體內(nèi)的NADP-ME 被分為光合型和非光合型兩種[6]。結(jié)合基因定位及功能[7]，目前NADP-ME 被分為以下幾類：C4植物維管束鞘細(xì)胞葉綠體型、C4植物質(zhì)體型、C4植物細(xì)胞質(zhì)型；CAM植物光合型（細(xì)胞質(zhì)型）、CAM植物非光合型（細(xì)胞質(zhì)型）；C3植物質(zhì)體型、C3植物細(xì)胞質(zhì)型。其中光合型為C4植物維管束鞘細(xì)胞葉綠體型和CAM 植物光合型，其主要功能是脫羧產(chǎn)生CO2用于RuBisCo 酶的碳固定及類似的作用[8]。除這兩類外，其它NADP-ME 均屬于非光合型，通過提供CO2、NADPH 和蘋果酸等來調(diào)節(jié)植物滲透壓、細(xì)胞內(nèi)pH、促進(jìn)果實(shí)成熟、氣孔運(yùn)動(dòng)以及脂肪酸的合成[9]，影響逆境相關(guān)的細(xì)胞生理功能。

在植物體中，NADP-ME基因家族較小，家族成員的數(shù)量因植物不同而異[10]。雖然NADP-ME基因家族各成員間的同源性較高，但其基因表達(dá)模式和生理生化特性差異較大[11]，因而在植物體內(nèi)也發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)功能。其中，植物胞質(zhì)型NADP-ME 主要參與其逆境防御及相關(guān)代謝活動(dòng)[12]。甜菜（Beta vulgarisL.）屬于C3作物，在我國(guó)東北、西北及華北地區(qū)種植，是我國(guó)北方重要的經(jīng)濟(jì)作物和糖料作物之一。近年來人們對(duì)不同碳同化途徑植物的NADP-ME基因家族進(jìn)行了一定的功能分析[13]，但對(duì)于甜菜的NADP-ME基因家族信息及其功能了解甚少。本文以全基因組信息已解讀的甜菜為對(duì)象，利用生物信息學(xué)對(duì)甜菜NADP-MEs家族成員的序列特征、蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)基序及進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)，為研究BvNADP-ME基因家族的生理功能提供基礎(chǔ)信息，并為進(jìn)一步提高甜菜對(duì)逆境的耐性和品質(zhì)提供新途徑。

1 試驗(yàn)方法

1.1 甜菜NADP-MEs基因的挖掘和蛋白的理化性質(zhì)分析

擬南芥種質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）檢索擬南芥NADP-ME基因家族蛋白質(zhì)序列。利用擬南芥NADP-ME（At1g79750）氨基酸序列進(jìn)行Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk）分析。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp 同源檢索，最終篩選并獲得甜菜NADP-ME家族的基因序列和蛋白序列。使用pI/Mw（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)所獲得的蛋白序列理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2 甜菜NADP-MEs基因結(jié)構(gòu)及其染色體定位分析

Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）分析獲得甜菜NADP-MEs家族的基因組DNA 及其CDS 序列，并利用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用Ensemblgenomes 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因所在染色體的位置、染色體長(zhǎng)度等信息；通過MG2C在線網(wǎng)站獲得甜菜NADP-ME基因家族的染色體定位。

1.3 甜菜NADP-ME家族基因蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPAM在線網(wǎng)站，對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）構(gòu)建甜菜NADP-ME家族基因蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[14]。

1.4 甜菜NADP-MEs的跨膜預(yù)測(cè)和導(dǎo)肽分析

通過PSORT（https://www.genscript.com/）對(duì)甜菜NADP-MEs序列所編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；并用TMHMM 在線網(wǎng)站對(duì)家族成員進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；最后用TargetP1.1 Server對(duì)甜菜NADP-MEs基因所編碼的蛋白進(jìn)行導(dǎo)肽分析。

1.5 甜菜NADP-ME家族蛋白的結(jié)構(gòu)序列比對(duì)及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用DNAMAN 對(duì)獲得的甜菜NADP-ME 家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域的分析。利用MEGA7 對(duì)擬南芥、菠菜、藜麥以及甜菜的NADP-ME 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，繪制無根進(jìn)化樹，構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹。

1.6 甜菜NADP-ME家族基因蛋白的基序分析

將已分析獲得的BvNADP-MEs氨基酸序列，利用MEME分析和預(yù)測(cè)保守基序，基序設(shè)定值為14個(gè)。

1.7 甜菜NADP-MEs基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

以甜菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及GFF3 文件為基礎(chǔ)，利用TBTOOLS 軟件獲取甜菜NADP-MEs基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，提交至Plantcare在線進(jìn)行順式作用調(diào)控元件的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜NADP-ME家族成員基本理化特性

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)Blast 分析，共獲得5 個(gè)甜菜NADP-ME家族成員（表1）。這5 個(gè)基因編碼了584～641個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為64 505.83 Da（BvNADP-ME1）～70 432.69 Da（BvNADP-ME3）。家族成員中僅有BvNADP-ME5等電點(diǎn)大于7，為堿性蛋白，其余均為酸性蛋白。

表1 甜菜NADP-MEs 蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of NADP-MEs protein in sugarbeet

甜菜NADP-ME 蛋白的平均親疏水性都為負(fù)值，說明該蛋白家族都屬于親水性蛋白；這些蛋白中，只有BvNADP-ME1和BvNADP-ME5的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余的均為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，除BvNADP-ME1 和BvNADP-ME2 分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)上以外，甜菜NADP-ME家族的大部分蛋白位于線粒體。

2.2 甜菜NADP-ME基因家族的結(jié)構(gòu)分析

如圖1 所示，甜菜NADP-MEs成員的基因長(zhǎng)度介于6 537 bp（BvNADP-ME2）～19 759 bp（BvNADPME4）。它們均為斷裂基因，并且內(nèi)含子數(shù)目較多。其中BvNADP-ME3內(nèi)含子數(shù)目高達(dá)19個(gè)，其余成員均在16～18個(gè)。

圖1 甜菜NADP-ME家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of NADP-ME family in sugar beet

2.3 甜菜NADP-MEs的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

α 螺旋和無規(guī)則卷曲是構(gòu)成甜菜NADP-ME 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件，β 折疊和延伸鏈則較少（表2）。其中只有BvNADP-ME3 的α 螺旋少于40%，而少于40%的都是質(zhì)體型NADP-ME，導(dǎo)肽分析也證明了這一點(diǎn)。利用SWISS-MODEL 建立了甜菜NADP-ME家族蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖2 發(fā)現(xiàn)，甜菜NADP-ME家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)多是由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成的，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（表2）結(jié)果一致。其中BvNADPME1、3、5的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常接近。因此，可以推測(cè)這3個(gè)蛋白在甜菜體內(nèi)的功能可能是類似的。

圖2 甜菜NADP-MEs蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of tertiary structure of NADP-MEs protein in sugar beet

表2 甜菜NADP-MEs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 2 Secondary structure of NADP-MEs protein in sugarbeet

2.4 甜菜NADP-ME基因家族的染色體定位及結(jié)構(gòu)分析

已知甜菜全基因組測(cè)序已被測(cè)定出的染色體是9 條，通過對(duì)所獲得的甜菜5 個(gè)BvNADP-MEs基因進(jìn)行染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，甜菜NADP-ME家族成員（BvNADP-ME5、2、1）主要分布在1、2、8 號(hào)染色體上，還有兩個(gè)基因（BvNADP-ME3、4）分別位于兩個(gè)零散的片段上，其中BvNADP-ME3位于9 號(hào)染色體上的scaffold，BvNADP-ME4位于1號(hào)染色體的scaffold，可能是全基因測(cè)序未能填補(bǔ)的gap區(qū)域（圖3）。甜菜NADP-ME基因家族在有限的染色體上分布，也進(jìn)一步地證明了該家族是一個(gè)相對(duì)較小的基因家族，其遺傳較為穩(wěn)定。

圖3 甜菜NADP-ME基因家族的染色體定位Fig.3 Chromosome location of NADP-ME gene family in sugar beet

另外，跨膜結(jié)構(gòu)與分析結(jié)果表明BvNADP-ME 家族的5 個(gè)蛋白均不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于跨膜蛋白。導(dǎo)肽分析結(jié)果表明，BvNADP-ME3 含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，BvNADP-ME4、5 均含有線粒體靶向肽。BvNADPME1、2則分別定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。信號(hào)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果中5個(gè)蛋白均未發(fā)現(xiàn)存在信號(hào)肽。

2.5 甜菜NADP-MEs序列及進(jìn)化分析

氨基酸同源性、保守區(qū)域及進(jìn)化關(guān)系顯示，甜菜NADP-ME 蛋白家族成員之間的氨基酸序列一致性為61.06%，每個(gè)成員均有5個(gè)保守的NADP-ME氨基酸區(qū)域（圖4）。其中，氨基酸保守區(qū)域I、II、V 是NADP的結(jié)合區(qū)域，但I(xiàn)II和IV 區(qū)域的功能尚不清楚[15]。

圖4 甜菜NADP-ME蛋白序列同源性及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Homology and conserved domain analysis of NADP-ME protein in sugar beet

如圖5所示，為了分析甜菜NADP-ME蛋白家族與擬南芥、菠菜和藜麥NADP-MEs的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)這4種植物的21 個(gè)NADP-MEs 構(gòu)建了6 個(gè)亞組（I～VI）系統(tǒng)發(fā)育樹。研究發(fā)現(xiàn)所有甜菜NADP-MEs 均屬于I、II、IV、VI 這4個(gè)亞組，其中VI亞組是甜菜所特有的一個(gè)亞組，而亞組III是屬于擬南芥所特有的一個(gè)類群。根據(jù)聚類顯示，BvNADP-ME1與SoNADP-ME1 同源關(guān)系最近。由此可以推測(cè)，甜菜與菠菜NADP-MEs親緣關(guān)系相對(duì)較近，其次是藜麥，最遠(yuǎn)是擬南芥。

圖5 NADP-ME家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of NADP-ME family protein

2.6 甜菜NADP-ME成員蛋白保守基序分析

甜菜NADP-MEs蛋白包含了14個(gè)保守基序，分別命名為Motif 1～14（圖6）。其中BvNADP-ME1、2、3包含所有14 個(gè)保守基序，BvNADP-ME4、5 則缺少M(fèi)otif 7、8、13、14。將Motif 的分析結(jié)果與保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Motif 2構(gòu)成I區(qū)域，Motif 1構(gòu)成II區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域是NADP的結(jié)合區(qū)域[15]。Motif3構(gòu)成III、IV區(qū)域，Motif12構(gòu)成V 區(qū)域，并在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中查到Motif1、2、3和motif 9、10都分布在N端，暗示該家族蛋白N端可能具有重要的生物學(xué)功能。

圖6 甜菜NADP-MEs家族蛋白基序分析Fig.6 Analysis of NADP-MEs family protein motifs in sugar beet

在14 個(gè)基序中，Motif4、Motif6、7、8 和Motif 11、12 可能與NAD 的結(jié)合有關(guān)。但在保守序列分析中提到motif12 構(gòu)成的V 區(qū)域是NADP 的結(jié)合區(qū)，與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)中分析出的結(jié)論有所差異，推斷可能是不同碳同化類型的植物其功能區(qū)的作用有所不同。另外，Motif 5、13、14 是未知的，在Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)未能找到相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域，這3個(gè)基序的功能還有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

2.7 甜菜NADP-ME基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

分析BvNADP-ME基因家族啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，結(jié)果（表3）顯示：各成員啟動(dòng)子均含有植物激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件，其中光響應(yīng)元件最多，有17 個(gè)位點(diǎn)，占總位點(diǎn)數(shù)的45.95%，這證明了甜菜NADP-ME基因在光合作用中的重要地位。

表3 甜菜NADP-ME 基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分析Table 3 Analysis of cis-acting elements of NADP-ME gene family promoter in sugarbeet

在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面，BvNADP-ME基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)域都含有脫落酸響應(yīng)元件(Abscisic acid re‐sponse element,ABRE)；在非生物脅迫方面，很值得一提的是BvNADP-ME3含有絕大部分的非生物脅迫響應(yīng)元件，其中包括干旱脅迫響應(yīng)元件MBS（1 個(gè)）、抗氧化調(diào)節(jié)元件ARE（2 個(gè)）、抗寒性啟動(dòng)子功能元件MYC（4個(gè)）、鹽脅迫啟動(dòng)子元件MYB（3 個(gè)）。另外，BvNADP-ME2、5都含有參與防御和應(yīng)激反應(yīng)元件。這進(jìn)一步說明了BvNADP-ME基因家族在植物逆境防御中起到一定的作用。上述結(jié)果表明BvNADP-ME家族基因可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)活動(dòng)并在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

在自然條件下，植物不斷遭遇各種環(huán)境的逆境脅迫，這些脅迫可能會(huì)限制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至產(chǎn)量。NADP-MEs被認(rèn)為在植物的不同脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]。其生物學(xué)功能在多種植物中得到了廣泛挖掘，但是該基因家族在甜菜中的信息較為缺乏。因此，利用生物信息學(xué)對(duì)甜菜NADP-ME基因家族的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域及同源性、蛋白質(zhì)基序等進(jìn)行分析，可為進(jìn)一步研究BvNADP-MEs的功能表達(dá)提供基礎(chǔ)信息。

本研究共鑒定得到5 個(gè)甜菜NADP-ME基因家族成員。同源檢索到與甜菜NADP-ME家族成員同源性較高的菠菜、藜麥和擬南芥，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，進(jìn)行比對(duì)的21個(gè)NADP-MEs基因可分為6個(gè)亞組，通過進(jìn)化分支來看，甜菜NADP-ME家族與擬南芥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與菠菜的親緣關(guān)系較近，這與它們?cè)谥参锓诸惿系挠H緣關(guān)系遠(yuǎn)近相同（同屬藜科二年生草本植物）。另外在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中存在的幾個(gè)不同物種的同源對(duì)，表明它們可能由共同祖先進(jìn)化而來，也暗示其在某些信號(hào)通路中可能具有相似結(jié)構(gòu)和功能。

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，BvNADP-ME3、4、5 與跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致，即BvNADP-ME3 含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，BvNADP-ME4、5均含有線粒體靶向肽；而BvNADP-ME1、2 則分別定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，但在其信號(hào)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果中卻并未發(fā)現(xiàn)存在信號(hào)肽，其作用機(jī)制及相關(guān)功能還有待進(jìn)一步研究。根據(jù)跨膜結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果可將BvNADP-ME3定義為非光合型的質(zhì)體型NADP-ME基因，而根據(jù)其亞細(xì)胞定位可以將BvNADP-ME2定義為非光合型的胞質(zhì)型NADP-ME基因。這預(yù)示著不同的BvNADP-MEs可能參與或調(diào)控不同的信號(hào)途徑，包括植物發(fā)育和逆境響應(yīng)[16]。

在桃果實(shí)發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)NADP-ME1和NADP-ME2的表達(dá)均隨著果實(shí)發(fā)育而增加。果實(shí)硬化期NADP-ME活性的增加為木質(zhì)素、苯丙素和類黃酮的合成提供了大量的NADPH[17]。另外，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致貯藏種子劣化的主要因素，研究表明擬南芥NADP-ME1功能缺失突變體的種子表現(xiàn)出比野生型更高的蛋白質(zhì)羰基化水平，與野生型相比，NADP-ME1功能缺失突變體在種子吸脹時(shí)，老化種子胚胎中積累了蘋果酸和氨基酸[18]。因此，認(rèn)為NADP-ME1 活性是種子干燥貯藏過程中保護(hù)種子不被氧化所必需的。在BvNADP-MEs啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果中，我們觀察到家族所有成員都具有抗氧化調(diào)節(jié)元件，這進(jìn)一步證明了甜菜NADP-ME基因?qū)τ诜N子活力的保持有一定的作用。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長(zhǎng)期的低溫誘導(dǎo)，黑麥蘋果酸含量或NADP-ME 活性會(huì)有所增加；當(dāng)?shù)蜏孛{迫解除后，蘋果酸含量和酶活性均下降[19]。這與甜菜NADP-ME基因家族啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析結(jié)果一致，試驗(yàn)觀察到甜菜NADP-MEs所有成員都含有抗寒性啟動(dòng)子功能元件（MYC）。此結(jié)果表明，NADP-ME不僅是一種良好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且還能響應(yīng)低溫造成的滲透脅迫。近年來，越來越多關(guān)于NADP-ME蛋白參與植物應(yīng)激反應(yīng)的研究被報(bào)道：干旱脅迫下，煙草葉片NADP-ME的合成顯著增強(qiáng)；但在恢復(fù)期間，酶活性又恢復(fù)到基礎(chǔ)水平[20]。通過啟動(dòng)子順式作用元件我們確實(shí)看到甜菜NADP-ME1、2、3含有干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）。究其原因，可能是NADP-ME通過在光合碳同化環(huán)節(jié)催化釋放CO2參與干旱脅迫響應(yīng)。在干旱脅迫下，植物關(guān)閉氣孔，導(dǎo)致CO2吸收減少，此時(shí)增加的NADP-ME可以彌補(bǔ)CO2的不足[21]，從而維持碳同化的反應(yīng)。此外，高鹽和脫水誘導(dǎo)了蘆薈NADP-ME基因（AvME）的表達(dá)，在高鹽脅迫誘導(dǎo)48 h 后，AvME 蛋白的表達(dá)顯著增加，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平逐漸升高[22]。這與順式作用表達(dá)元件分析結(jié)果也一致，整個(gè)NADP-ME基因家族中，只有NADP-ME4不含有鹽脅迫啟動(dòng)子元件。

本研究中，BvNADP-ME1、2的亞細(xì)胞定位結(jié)果與信號(hào)肽結(jié)果不符，蛋白質(zhì)基序Motif12 的功能與在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)里查詢到的結(jié)果有一定差異，這些都需進(jìn)行進(jìn)一步的研究鑒定。此外，根據(jù)蛋白質(zhì)基序分析表明，BvNADP-ME 蛋白存在與NAD 結(jié)合相關(guān)的基序，這暗示著BvNADP-MEs可能參與了糖酵解，糖異生和三羧酸循環(huán)等過程，與植物體的代謝途徑密不可分。本研究結(jié)果不僅為分子抗性育種的發(fā)展提供基礎(chǔ)，還為利用基因編輯技術(shù)增強(qiáng)甜菜抗逆性，進(jìn)一步提高其產(chǎn)量和品質(zhì)提供基礎(chǔ)信息和研究思路。