黃三素鏈霉菌15-6發(fā)酵液的抑菌活性研究

張雨陽(yáng)，魏有海，郭良芝，程 亮，朱海霞，郭青云

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

植物病害是降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力的因素之一，其中植物病原真菌可以引起葉斑病、穗腐病、根腐病、霉變、種子變色等嚴(yán)重病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；不僅如此，有些植物病原真菌也會(huì)導(dǎo)致人畜疾病[1-2]。使用化學(xué)藥劑防治植物病害會(huì)引起很多副作用，因此生物防治由于副作用小而逐漸成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展新趨勢(shì)。鏈霉菌具備寬泛的抗菌能力，可以產(chǎn)出多種活性物質(zhì)，如植物激素、抗生素等。這些物質(zhì)不僅可以增加植物的抗逆性和抗病性，還可作為生物農(nóng)藥進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用[3-4]。以求進(jìn)一步將該菌株得用于試劑生產(chǎn)，在差別條件下對(duì)該菌株發(fā)酵液的抗菌活性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為后續(xù)開(kāi)發(fā)該菌株作為生物農(nóng)藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

青海省農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存黃三素鏈霉菌15-6和12種病原菌。

Gao’s No.1培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.0 g，KNO30.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1 L，pH值7.4～7.6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g,葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，自然pH值。

1.2 鏈霉菌15-6無(wú)菌發(fā)酵液的制備

將活化菌株15-6接種于Gao’s No.1發(fā)酵培養(yǎng)基，以180 r/min在28℃條件下利用搖床搖勻，恒溫條件下培育5 d， 收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液以10 000 r/min的速度離心30 min，收集上清液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，制備無(wú)菌發(fā)酵濾液完成。

1.3 抑菌譜測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法

取菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵濾液1 mL加入到直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，與冷卻至 50 ℃的9 mL PDA 培養(yǎng)基混勻制成帶毒平板，用無(wú)菌打孔器打取5種病原菌菌餅（直徑為 5 mm），菌苔向下放置于帶毒平板的中央，以無(wú)菌水與PDA制成的平板為對(duì)照。28 ℃條件 下培養(yǎng)，記錄櫻桃葉斑病菌的菌落直徑，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并按公式（1）計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）×100% （1）

1.4 檢測(cè)拮抗菌株發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

1.4.1 熱穩(wěn)定性 在60、80和100℃的不同條件下，將菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵濾液分別處理30和60 min，而后在121 ℃條件下滅菌20 min，CK為未經(jīng)溫度處理的發(fā)酵液，按方法1.3用生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)芒果膠孢炭疽菌的抑菌活性。

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性 pH值設(shè)為 1.0～13.0間等間隔的13個(gè)梯度，菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵液的pH值用HCI 和NaOH溶液進(jìn)行酸堿度調(diào)節(jié)，靜置24 h后，調(diào)回發(fā)酵液的原始酸堿度（pH值= 7.2），測(cè)定菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)芒果膠孢炭疽菌的抑菌率。

1.4.3 酶穩(wěn)定性 酶的最終濃度是50 mg/L，把溫度設(shè)定為37℃。用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K分別處理菌株15-6發(fā)酵液0.5、1.0、1.5和2.0 h。通過(guò)測(cè)定菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)炭疽菌的抑制效果，獲得對(duì)蛋白酶的耐受性。

1.4.4 對(duì)紫外線(xiàn)穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定 將菌株15-6發(fā)酵液用紫外燈照射10、20、30、40、50、60 min，使用功率為30 W的紫外燈，照射距離為30 cm。測(cè)定菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)芒果炭疽菌的抑菌率。

1.4.5 重金屬離子的穩(wěn)定表現(xiàn) 在無(wú)菌濾液中加入NaCl、KCl、CaCl2和FeCl3溶液，直至金屬離子濃度達(dá)到0.05 mol/L，以不含金屬離子的無(wú)菌濾液為對(duì)照，測(cè)定菌株15-6無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)芒果炭疽菌的抑制率。

1.5 菌株15-6的鑒定

形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)特性觀察：菌株15-6接種于Gao’s No.1培養(yǎng)基，將滅菌后的蓋玻片斜插于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)7 d，28℃ ，取蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲和孢子鏈的形態(tài)特征，在PDA培養(yǎng)基上接種該菌株，之后在溫度為28℃的條件下持續(xù)培養(yǎng)8～15 d，在此期間，觀察菌絲和氣生菌絲的生長(zhǎng)情況及可溶性色素的產(chǎn)生與否。

生理生化特性測(cè)定：參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》測(cè)定菌株的明膠液化、淀粉水解、纖維素分解、過(guò)氧化氫酶、硝酸鹽還原及生長(zhǎng)溫度等各項(xiàng)試驗(yàn)[5-6]。

菌株16S rRNA分子鑒定：采用CTAB法提取基因組DNA，用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和1492r：5′-CTACGGCTACCTTGTTAC GA-3′，對(duì) 基 因 組DNA進(jìn) 行16S rRNA片 段 擴(kuò) 增。PCR反應(yīng)體系為：95 °C、5 min；94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)3 μL PCR產(chǎn)物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司檢測(cè)。將16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，下載同源性較高的序列。采用MEGA 5.0中Neighbor-Joint法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株15-6發(fā)酵液的抑菌譜的測(cè)定

從表1中可以看出，15-6 菌株發(fā)酵液除對(duì)油菜菌核病的抑制作用為 45.29%外，抑制率在50%以上是其他11種供試病原菌。其中抑制率最高的是芒果炭疽病菌，為80.34%，之后是大麥條紋病和芒果莖腐病，分別為73.14%和71.47%，可見(jiàn)菌株15-6的發(fā)酵液抗菌范圍較廣。

表1 菌株15-6發(fā)酵液的抑菌譜

2.2 菌株15-6發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

指示菌是膠孢炭疽菌。從圖1中可以明顯看出，在受到顯著不同的溫度處理過(guò)后，菌株15-6的發(fā)酵液良好的熱穩(wěn)定性和抗菌活性仍然表現(xiàn)顯著。在60℃以及80℃時(shí)利用不同時(shí)間處理后抗菌效果表現(xiàn)出無(wú)明顯的改變， 但是當(dāng)溫度明顯高于80℃時(shí)，發(fā)酵液的抗菌活性明顯降低，發(fā)酵液經(jīng)100℃高壓蒸汽滅菌后，抑菌率僅是43.39%，當(dāng)121℃高壓蒸汽滅菌后，它的抑菌率僅是4.23%。

圖1 菌株15-6發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性

2.3 菌株15-6發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

由圖 2 可見(jiàn)，菌株15-6發(fā)酵液的抗菌活性對(duì)酸堿度敏感。當(dāng)pH值為3和5時(shí)，抑菌率分別為59.02%和30.37%，當(dāng)pH值為7時(shí)，抑菌率最高。為80.34%。抑菌率在pH值為9時(shí)為60.26%，pH值為11時(shí)為42.49%，pH值為13時(shí)僅為11.32%。

圖2 菌株15-6發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性

2.4 菌株15-6發(fā)酵液的酶穩(wěn)定性

從圖3可以得出，不同蛋白酶對(duì)菌株15-6發(fā)酵液的抗菌活性沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明發(fā)酵液的抗菌效果對(duì)3種被測(cè)蛋白酶顯示不敏感。

圖3 菌株15-6發(fā)酵液的蛋白酶穩(wěn)定性

2.5 紫外照射下菌株15-6發(fā)酵液的穩(wěn)定性

紫外輻射穩(wěn)定性是開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥的重要指標(biāo)之一，從圖4可以看出，菌株15-6發(fā)酵液在紫外輻射30 min內(nèi)的抑制率低于對(duì)照。在經(jīng)過(guò)40 min以后，由于紫外光照射時(shí)間的不斷加長(zhǎng)，顯著降低了它的抑制活性，但60 min后抑制率僅是37.14%。

圖4 菌株15-6發(fā)酵液的紫外線(xiàn)照射穩(wěn)定性

2.6 菌株15-6發(fā)酵液中重金屬離子的穩(wěn)定性

從圖5可以看出，不同重金屬離子對(duì)菌株15-6發(fā)酵液的抑菌活性無(wú)顯著影響，表明該發(fā)酵液對(duì)所測(cè)4種金屬離子的抑菌效果不具有敏感性。

圖5 菌株15-6發(fā)酵液的重金屬離子穩(wěn)定性

2.7 菌株15-6的鑒定

2.7.1 菌株15-6的形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn) 革蘭氏染色陽(yáng)性。菌株在Gao’s No.1培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落呈扁平、圓形或近圓形。正面白色，背面深褐色，無(wú)可溶性色素。菌絲生長(zhǎng)發(fā)育良好，無(wú)裂口和隔膜；氣生菌絲生長(zhǎng)良好，分枝多，孢子絲直而柔韌，孢子圓或卵圓形，表面光滑（圖6）。這些特征與鏈霉菌一致。2.7.2 生理生化試驗(yàn) 由表2可知菌株15-6能利用葡萄糖、半乳糖、赤蘚糖和海藻糖分解含硫氨基酸，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，淀粉水解，明膠液化，產(chǎn)生吲哚乙酸和過(guò)氧化氫，但纖維素不能水解，硝酸鹽減少，脲酶反應(yīng)為陰性，不使用解蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖和甘露醇。

圖6 菌株15-6的形態(tài)

表2 菌株15-6生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.7.3 菌株15-6 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)菌株15-6的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（生物工程（上海）有限公司）。與GenBank中的基因序列然后進(jìn)行在線(xiàn)地比對(duì)，結(jié)果顯示，該序列與多個(gè)菌株的16S rDNA序列具有99.99%的同源性。以16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析說(shuō)明為基準(zhǔn)，菌株15-6與登錄號(hào)為NR112268.1和KF730779.1黃三素鏈霉菌Streptomyces flavotricini的親緣關(guān)系最近，屬于同一系統(tǒng)發(fā)育分支（圖7）。

圖7 基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié) 論

黃三素鏈霉菌15-6發(fā)酵液對(duì)12種供試植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)都有較強(qiáng)的抑制效果，其中對(duì)芒果炭疽菌的抑制率最強(qiáng)為80.34%。指示菌為芒果膠孢炭疽菌，在溫度低于80℃時(shí)15-6 菌株發(fā)酵液熱穩(wěn)定性較好；對(duì)酸堿性條件很敏感，pH值在6～8時(shí)抗菌作用較強(qiáng)；在紫外線(xiàn)照射下具有穩(wěn)定性良好的特性，對(duì)重金屬離子和蛋白酶表現(xiàn)出不敏感的性質(zhì)。綜上所述，該菌株的具體抗菌機(jī)制和活性物質(zhì)還必須進(jìn)一步進(jìn)行探討研究。

4 討 論

目前植物病害的主要防治方法是殺菌劑等化學(xué)防治方法，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑不僅容易威脅人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境，而且容易導(dǎo)致土壤污染、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。生物防治是一種符合安全、健康和環(huán)境保護(hù)要求的可持續(xù)發(fā)展手段。目前對(duì)于芒果膠孢炭疽菌的生物防治已有許多報(bào)道。

楊苑等[7]篩選的抗生素溶桿菌L-44對(duì)云南芒果采后炭疽病原菌的抑制率達(dá)53.70%；何秀娟[8]篩選的瓦爾維亞假絲酵母X-1對(duì)炭疽病的發(fā)病率控制在40%以下，與200 mg/L的多菌靈的防治效果無(wú)明顯差異；趙超等[9]從芒果葉片與果實(shí)分離篩選出2株對(duì)芒果采后炭疽病原菌具有較好抑制效果的熒光假單胞菌A1和枯草芽孢桿菌C13，兩者的10倍發(fā)酵稀釋液的防效分別為80.05%和71.73%。基于此發(fā)現(xiàn)，生物防治芒果膠孢炭疽菌的相關(guān)生防菌多集中于酵母菌和細(xì)菌。該研究篩選出1株對(duì)芒果膠孢炭疽菌有較強(qiáng)抑制作用的鏈霉菌，而關(guān)于鏈霉菌對(duì)該菌的生物防治研究較少。鄭金土等[10]研究結(jié)果表明，黃三素鏈霉菌YZF3對(duì)楊梅潰瘍病菌有較強(qiáng)的抑制作用。薛磊等[11]報(bào)道，黃三素鏈霉菌能顯著抑制大麗輪枝菌（Verticillum dahliae）菌絲生長(zhǎng)、微菌核形成及萌發(fā)，在防治由大麗輪枝菌引起的黃萎病中有使用潛力。Khalil等[12]從稻田獲得的黃三素霉菌，該菌的代謝產(chǎn)物綠黃菌素對(duì)水稻稻瘟病菌有明顯的抑制作用。Patil等[13]分離到的黃三素鏈霉vh8菌能保護(hù)番茄根部減少茄絲核菌（Rhizoctoni solani）侵染，防治效果達(dá)59.86%，還具有促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)作用。黃三素鏈霉菌的抑菌機(jī)制在不同的方面有不同的表現(xiàn)，不同的菌株可能有不同的抗菌機(jī)制，但它們主要產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。抑菌活性物質(zhì)主要有抗菌蛋白和抗生素等[14-15]。