響應(yīng)面法優(yōu)化巨大口蘑多糖提取工藝及抗氧化活性

胡棟寶，杜薇，楊猛

(玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院, 云南 玉溪 653100)

巨大口蘑(Tricholomagiganteum)，別名大口蘑、大白口蘑等，是一種珍稀的大型食用菌[1]。其子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑制高血壓、抑制細(xì)菌等多種生理功能[2-3]。研究表明巨大口蘑子實(shí)體含有多糖、多酚、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、粗纖維及多種微量元素。巨大口蘑是一種高品位的食用菌與保健食品，常被添加在保健食品或者調(diào)味品中來(lái)提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，如梁大偉等將巨大口蘑粉添加在餅干中制成了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的食品，適用于現(xiàn)代化工廠化生產(chǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景[4]。真菌多糖是一類(lèi)可以控制細(xì)胞分裂和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老的活性多糖，具有明顯的抗菌、降血糖、抗氧化、降血脂等作用。目前，有關(guān)響應(yīng)曲面法優(yōu)化巨大口蘑多糖提取工藝及抗氧化活性的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為了充分利用該食用菌資源，本研究利用超聲波輔助提取響應(yīng)面優(yōu)化法獲取多糖提取的最佳工藝條件，在此基礎(chǔ)上，利用DPPH自由基清除等試驗(yàn)研究巨大口蘑多糖提取物的抗氧化活性，將為巨大口蘑食用菌資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大口蘑：采自云南省普洱市；葡萄糖、乙醇、濃硫酸、苯酚、過(guò)硫酸鉀：四川西隴化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：美國(guó)Sigma公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸：均為國(guó)產(chǎn)分析純，天津市雙船化學(xué)試劑廠。

UV-2700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 河南鞏義市予華儀器有限公司；超聲儀 上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取工藝

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5000 g巨大口蘑粉末，采用經(jīng)典的水提醇沉法[5]，加入一定體積的蒸餾水進(jìn)行超聲波提取，提取2次，然后進(jìn)行抽濾，合并濾液，在濾液中加入3倍體積的95%乙醇于4 ℃的冰箱中放置12 h進(jìn)行醇沉，然后進(jìn)行離心,得到多糖沉淀，用蒸餾水進(jìn)行復(fù)溶并定容至25 mL，得到多糖溶液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對(duì)多糖提取率的影響

固定反應(yīng)條件為超聲時(shí)間30 min、超聲提取次數(shù)2次時(shí)，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)對(duì)巨大口蘑多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

固定反應(yīng)條件為液料比為25∶1、提取2次時(shí)，考察不同超聲時(shí)間(10，20，30，40，50，60 min)對(duì)其多糖得率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

固定反應(yīng)條件為液料比25∶1、超聲時(shí)間40 min時(shí)，考察巨大口蘑提取1，2，3次時(shí)對(duì)其多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

用Design Expert 8.0.6軟件并在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，將3個(gè)因素作為變量來(lái)探究它們對(duì)巨大口蘑多糖得率的影響，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.4 多糖得率的計(jì)算

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

將100 mg葡萄糖用100 mL的蒸餾水溶解配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL葡萄糖溶液，取10.00 mL上述溶液稀釋成0.1 mg/mL，分別移取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，每份加蒸餾水到2.0 mL,加5%的苯酚溶液1.00 mL，加濃硫酸溶液5.00 mL，于陰暗處放置30 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度值，平行3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),所得方程為y=45.114x-0.0101,相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，擬合程度較好。

1.2.4.2 多糖的測(cè)定及得率的計(jì)算

(1)

式中：W為多糖得率，%；c為提取液中多糖的含量，mg/mL；V1為比色液體積，mL；V2為定容體積,mL；V3為供試樣品體積,mL；m為試驗(yàn)樣品質(zhì)量,mg。

1.2.5 巨大口蘑多糖的抗氧化試驗(yàn)

1.2.5.1 多糖對(duì)DDPH自由基的清除率

取兩份不同濃度的巨大口蘑多糖溶液(0.01，0.02，0.03，0.04 mg/mL)于比色管中，分別加入2.00 mL DPPH溶液和2.00 mL 95%乙醇溶液混合均勻，室溫靜置30 min，以含95%乙醇的樣品溶液為空白對(duì)照，在517 nm處測(cè)定Ai和Aj的吸光度；以95%乙醇替代不同體積的多糖溶液，測(cè)吸光度Ac，以Vc做陽(yáng)性對(duì)照，平行3次試驗(yàn)。

計(jì)算DPPH自由基清除率[6]，公式如下：

DPPH自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。

(2)

1.2.5.2 多糖對(duì)ABTS+自由基的清除率

移取2.00 mL不同質(zhì)量濃度(0.01，0.02，0.03，0.04 mg/mL)的巨大口蘑多糖溶液，加入4.00 mL預(yù)混合的ABTS溶液搖勻,室溫下放置10 min，在波長(zhǎng)為734 nm處測(cè)吸光度Ai, 將巨大口蘑多糖溶液換成無(wú)水乙醇加入ABTS測(cè)得Ac，無(wú)水乙醇代替ABTS加入巨大口蘑多糖溶液測(cè)得Aj，平行3次試驗(yàn)，以Vc做陽(yáng)性對(duì)照，由公式計(jì)算ABTS+自由基清除率[7]：

ABTS+自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。

(3)

1.2.5.3 多糖的還原力

分別加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液和濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04 mg/mL的多糖溶液1.00 mL和2.5 mL 1%鐵氰化鉀，于50 ℃反應(yīng)20 min，冷卻后依次加入2.50 mL 10%三氯乙酸停止反應(yīng)，離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3，混合均勻放置10 min,在700 nm處測(cè)吸光度，平行3次，以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比

固定超聲時(shí)間為30 min，超聲提取次數(shù)2次，考察不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g)對(duì)多糖得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 The effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，當(dāng)液料比在5∶1～25∶1的范圍內(nèi)，多糖提取率呈上升的趨勢(shì)，并且在25∶1時(shí)達(dá)到峰值，在30∶1～40∶1時(shí)其得率逐漸下降，可能是由于增加提取液體積有利于增大其與浸提物的接觸面積，使多糖能夠較多溶出，當(dāng)提取液達(dá)到一定體積時(shí)多糖溶出會(huì)達(dá)到飽和，多糖得率會(huì)趨于平穩(wěn)或者緩慢下降[8]。因此，最佳液料比選為25∶1。

2.1.2 超聲時(shí)間

確定液料比為25∶1、提取2次的條件下，研究不同超聲時(shí)間(10，20，30，40，50，60 min)對(duì)巨大口蘑多糖得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間在10～40 min內(nèi)，多糖得率逐步增加，一旦超過(guò)40 min其得率開(kāi)始連續(xù)下降，可能原因是超聲時(shí)間太短，多糖不能充分溶出，達(dá)到最大提取率后含量大幅降低。因此，最佳超聲時(shí)間為40 min。

2.1.3 超聲提取次數(shù)

確定液料比為25∶1、超聲時(shí)間為40 min的前提下，研究巨大口蘑提取1，2，3次時(shí)對(duì)巨大口蘑多糖得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic extraction times on extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)其得率達(dá)到最高，之后得率開(kāi)始急劇下降，可見(jiàn)超聲提取次數(shù)對(duì)巨大口蘑多糖得率有很大的影響。因此，此試驗(yàn)最佳的提取次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)表2中的三因素三水平生成17組試驗(yàn)，驗(yàn)證得到其條件下所對(duì)應(yīng)的多糖得率[9-10]，結(jié)果見(jiàn)表2。得到回歸方程：Y=4.45+0.031A+0.041B+0.065C-7.500E-003AB+1.000E-002AC-0.030BC-0.83A2-0.35B2-0.20C2,該模型的R2=0.9960,校正系數(shù)RAdj2=0.9910。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

2.3 響應(yīng)面交互作用分析試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)方案作出響等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖4。

圖4 不同影響因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface and contour plots of the interaction of different influencing factors

由表3可知，模型的P<0.0001顯著性表現(xiàn)為非常顯著，失擬殘差項(xiàng)P=0.9276>0.05，表現(xiàn)為不顯著[11]。因此，該模型可應(yīng)用于巨大口蘑多糖提取試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。在方差分析表中用F值來(lái)衡量該因素對(duì)提取率的影響，F(xiàn)值越大其影響程度也越明顯，P值越小其影響程度越明顯[12-13]。在一次項(xiàng)A，B，C 3個(gè)影響因素中發(fā)現(xiàn)C因素的F=15.24最大, 可見(jiàn)其對(duì)試驗(yàn)的影響極顯著,B，A次之。二次項(xiàng)中A2極顯著,B2、C2顯著。響應(yīng)面圖中越陡峭則顯示該因素對(duì)其影響越明顯，反之，越平坦則影響不明顯。等高線(xiàn)圖可以依據(jù)其圖形的形狀來(lái)判斷其交互影響的程度，若圖形為橢圓則交互現(xiàn)象越明顯[14-15]。

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variance

2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)以上響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒Y(jié)果分析，得出最佳提取條件下巨大口蘑多糖的提取率為4.28452%，應(yīng)用至實(shí)際中(液料比27∶1(mL/g)、超聲時(shí)間40 min、超聲提取次數(shù)2次)，此時(shí)巨大口蘑多糖的得率是3.96%。該優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)論準(zhǔn)確可靠，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)后續(xù)的抗氧化試驗(yàn)。

2.5 巨大口蘑多糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

由圖5～圖7可知，DPPH、ABTS+的清除作用隨著巨大口蘑多糖溶液質(zhì)量濃度的增加而逐漸加強(qiáng)并逐步接近Vc的清除作用，呈現(xiàn)出一定的線(xiàn)性關(guān)系。在濃度為0.04 mg/mL時(shí)，巨大口蘑多糖提取液對(duì)DPPH、ABTS+自由基具有強(qiáng)的清除活性, 清除率達(dá)80%。由圖7可知，巨大口蘑多糖溶液同時(shí)也具有一定的還原能力，它也隨著巨大口蘑多糖質(zhì)量濃度的增加而增加。

圖5 多糖清除DPPH自由基能力Fig.5 The DPPH free radical scavenging ability of polysaccharides

圖6 多糖清除ABTS+自由基能力Fig.6 The ABTS+ free radical scavenging ability of polysaccharides

3 結(jié)論

利用超聲波輔助提取巨大口蘑多糖，依據(jù)單因素試驗(yàn)，采取三因素三水平響應(yīng)面分析方法探討其對(duì)多糖得率的影響。優(yōu)化巨大口蘑多糖最佳提取工藝條件為：液料比27∶1(mL/g)、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)2次，與預(yù)測(cè)模型結(jié)果接近，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。巨大口蘑多糖抗氧化活性隨著其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除活性較強(qiáng)，可以作為潛在的天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)。