果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的應(yīng)用

高敏，陸寧

(1.云南輕紡織職業(yè)學(xué)院，昆明 650300；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，合肥 230036)

果膠是一種天然的食品添加劑，具有乳化、增稠和膠凝作用，被廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]。同時(shí)，果膠也兼具天然的抗輻射功能和養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚功能，目前如何將其應(yīng)用于化妝品加工中成為果膠應(yīng)用領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。天然果膠物質(zhì)廣泛存在于植物的果實(shí)與根莖中，通常以原果膠、果膠和果膠酸形態(tài)存在。目前多以干燥的檸檬皮、蘋果皮作為果膠的主要來源，此外，菠蘿皮也富含果膠，可以作為果膠生產(chǎn)的原料[3]。

在食品加工領(lǐng)域，使用果膠添加劑可以對食品的口感、質(zhì)地、形狀和存儲時(shí)間進(jìn)行一定的優(yōu)化。由于其與糖的口感相似且具有脂肪一般的質(zhì)地，因此，多使用其去糖與脂肪，對口感缺失的食品進(jìn)行口感恢復(fù)。由文獻(xiàn)研究可知，從不同的原料中提取到的果膠，甲酯化程度會出現(xiàn)一定的差異。在果膠使用的過程中由于果膠酯化基團(tuán)分布的差異性，不同的果膠與食品的結(jié)合效果也有所不同[4]。為了對其在食品中的使用進(jìn)行更加深入的了解，此次研究將對果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的應(yīng)用進(jìn)行試驗(yàn)，以期為果膠甲酯酶類添加劑的使用提供引導(dǎo)與新的方向。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料來源

果膠常在植物體內(nèi)以不溶于水的原果膠形式存在，因此，在研究中需選定部分植物作為果膠提取原料，并結(jié)合合適的化學(xué)試劑完成添加劑樣本制備過程。化學(xué)試劑選擇結(jié)果及純度見表1。

表1 化學(xué)試劑Table 1 The chemical reagents

使用上述選取的試劑與原料，完成果膠甲酯酶類添加劑的制取過程。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

此次研究中所需設(shè)備見表2，將上述設(shè)備安裝到實(shí)驗(yàn)室中，組成相應(yīng)試驗(yàn)設(shè)備系統(tǒng)。

表2 主要儀器Table 2 The main instruments

續(xù) 表

1.3 樣本制備

根據(jù)文獻(xiàn)研究結(jié)果及以往試驗(yàn)環(huán)節(jié)設(shè)定情況，制備流程見圖1。

圖1 果膠甲酯酶類添加劑樣本制備流程Fig.1 The preparation process flow of pectin methylesterase additive samples

1.4 樣本制備工藝要點(diǎn)

原料處理：獲取新鮮果膠原料，使用剪刀將其分割為若干份，滅活酶處理后，將其放置于65 ℃干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥處理。每15 min翻動一次，完全烘干后使用粉碎機(jī)打碎，過篩待用。

果膠提?。捍谁h(huán)節(jié)分為酸提取與酶提取兩部分。將適量的蒸餾水加入粉碎過篩的原料中，攪拌均勻后加入適量的酸，調(diào)節(jié)pH值，在恒溫水浴鍋中酸解，使用濾布過濾酸提取液。在過濾后的提取液中加入適量的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值，加入適量的酶，混合均勻后使用恒溫水浴鍋進(jìn)行溶液中酶的降解。根據(jù)以往試驗(yàn)中設(shè)定的反應(yīng)時(shí)間，設(shè)計(jì)此環(huán)節(jié)的處理時(shí)間，并選擇合適的濾布對提取液進(jìn)行過濾。

果膠沉淀：在過濾后的溶液中滴入適量的乙醇，混合均勻后調(diào)節(jié)pH值。沉淀一段時(shí)間后，使用離心機(jī)對其進(jìn)行處理，得到果膠沉淀物。提取沉淀物放置于鼓風(fēng)干燥箱中烘干到恒重，得到果膠樣本。

在此環(huán)節(jié)中使用的果膠得率公式如下：

(1)

式中：C表示果膠得率，v1表示果膠質(zhì)量，g1表示原料干燥粉末質(zhì)量。

使用電子天平稱取0.5～1.0 g果膠，將其完全溶解至100 mL蒸餾水中，在溶液中滴入酚酞指示劑[5-6]，使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定變色，而后加入5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，放置于室溫中皂化3 h，使用0.1 mol/L硫酸溶液滴定至褪色，完成樣本甲氧基含量的測定過程，具體甲氧基含量計(jì)算公式如下：

(2)

式中：D表示甲氧基含量，h1表示皂化時(shí)加入的氫氧化鈉溶液體積，d1表示皂化時(shí)加入的氫氧化鈉溶液濃度，h2表示滴定皂化后剩余堿液的硫酸體積，d2表示滴定皂化后剩余堿液的硫酸濃度，m表示測定過程中的果膠質(zhì)量，0.031表示甲氧基的毫摩爾數(shù)。

將配制好的果膠樣本倒入干凈的烏氏粘度計(jì)中，保證其刻度線垂直于地面后，將烏氏粘度計(jì)放置于35 ℃恒溫水浴鍋中，等待粘度計(jì)的刻度線全部浸入溶液中，恒溫處理10 min。使用洗耳球?qū)⑷芤河擅?xì)管口吹下，攪拌。而后，等待溶液自由下落，當(dāng)測定溶液自由流向兩球之間刻度線時(shí)，按下秒表暫停計(jì)時(shí)。反復(fù)測定3次，取測定結(jié)果平均值作為最后輸出結(jié)果。粘度計(jì)控制測定流速在120～200 s最佳。樣本粘度計(jì)算公式如下：

P=α×J。

(3)

式中：α表示樣本流經(jīng)時(shí)間，J表示粘度計(jì)常數(shù)，P表示運(yùn)動粘度。通過上述計(jì)算過程，確定果膠甲酯酶類添加劑的制取條件。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酯化度測定

為保證樣本的酯化程度符合此次研究的需要，使用滴定法測試果膠酯化度。在獲取到的果膠溶液中滴入適量的蒸餾水，將其配制為15 mL 0.1% (W/V)的樣本溶液。在樣本中滴加2～3滴酚酞指示劑，并使用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至變色，將滴入的氫氧化鈉溶液體積記作A1。隨后，在此溶液中緩慢加入15 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，使用磁力攪拌器攪拌20 min，得到甲酯化果膠。最后，在此溶液中滴入15 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定酚酞指示劑變色，在此環(huán)節(jié)中消耗的氫氧化鈉溶液體記作A2。設(shè)定酯化度為B，則有：

(4)

2.2 果膠酶活力測定

在15 mL的比色管中滴入2.0 mL 2%的樣本溶液，在45 ℃條件下保溫5 min，加入0.5 mL稀釋酶液后開始計(jì)數(shù)，在45 ℃環(huán)境下反應(yīng)30 min，滴入3 mL DNS溶液后，終止反應(yīng)。沸水浴10 min，將溶液稀釋至20 mL，取1 mL溶液加入蒸餾水稀釋至5 mL，在550 nm處測定吸光值，對照D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[7-8]獲取還原糖含量，計(jì)算果膠酶活力。具體果膠酶活力計(jì)算公式如下：

(5)

式中：F表示果膠酶活性，n表示反應(yīng)過程中生成的還原糖含量，194.14表示葡萄糖的摩爾質(zhì)量，v表示反應(yīng)溶液體積，t表示反應(yīng)時(shí)間，E表示酶液濃度。

2.3 食品pH值對果膠酶使用效果影響測定

稱取10 mL果膠添加劑樣本，使用檸檬酸溶液將其pH值調(diào)節(jié)為3.5，并使用pH值為3.5的緩沖液將其定容至100 mL。分別配制pH值為3.8，4.0，4.2，4.4的食品材料。取12支比色管，每3支一組，分別注入pH 3.8，4.0，4.2，4.4的食品材料3 mL以及果膠酶溶液1 mL,在40 ℃環(huán)境下反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用滴管取上清液，利用分光光度計(jì)測量其透光度，繪制變化曲線。

2.4 果膠酶處理時(shí)間對其使用效果影響測定

取12支比色管，每3支一組，以每支比色管中抽取2.3測定環(huán)節(jié)中得到的最佳pH值食品稀釋液3 mL。加入1 mL相應(yīng)pH值的果膠酶溶液后，在40 ℃環(huán)境中，反應(yīng)15，30，45，60 min反應(yīng)結(jié)束后，使用滴管取上清液，利用分光光度計(jì)測量其透光度，繪制變化曲線。

2.5 果膠酶處理溫度對其使用效果影響測定

取12支比色管，每3支一組以每支比色管中抽取2.3測定環(huán)節(jié)中得到的最佳pH值食品稀釋液3 mL。加入1 mL相應(yīng)pH值的果膠酶溶液后，分別放置于30，35，40，45 ℃環(huán)境中反應(yīng)60 min，在每個(gè)溫度條件下取3組測定結(jié)果平均值作為最終結(jié)果。使用滴管取上清液，利用分光光度計(jì)測量其透光度，繪制變化曲線。

2.6 果膠酶添加量對其使用效果影響測定

取12支比色管，每3支一組并進(jìn)行編號。以每支比色管中抽取2.3測定環(huán)節(jié)中得到的最佳pH值食品稀釋液3 mL，而后在1～4號中分別加入1 mL蒸餾水、稀釋倍數(shù)3.4，700，14，75.20 U/mL的添加劑溶液。根據(jù)上述兩部分測定結(jié)果，設(shè)定處理時(shí)間和溫度，處理后使用滴管取上清液，利用分光光度計(jì)測量其透光度，繪制變化曲線。

2.7 數(shù)據(jù)處理

本次研究中所有測定方案均進(jìn)行3次，并采用SPSS 24.0和Origin 2017軟件[9-10]對數(shù)據(jù)和圖表進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)之間差異使用SPSS 24.0完成計(jì)算過程。

3 結(jié)果與分析

3.1 果膠甲酯酶類添加劑基本性能測定結(jié)果分析

通過測定可知，使用滴定法可得到不同果膠的酯化度。由圖2可知，所有果膠的酯化度均在29.00%～72.50%之間，此種添加劑的酯化度符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖2 果膠添加劑酯化度測定結(jié)果Fig.2 The determination results of esterification degree of pectin additives

由圖3可知，此次試驗(yàn)中果膠酶的活性完全符合食品添加劑的使用要求，因此可以使用此次樣品制備中獲取的果膠酶添加劑作為試驗(yàn)測定的對象，開展后續(xù)的測定環(huán)節(jié)。

圖3 果膠酶活力測定結(jié)果Fig.3 The determination results of pectinase activity

3.2 食品pH值對果膠酶使用效果影響分析

食品樣本的pH值對食品添加劑的使用效果具有一定的影響。同時(shí)也會影響添加劑內(nèi)果膠的穩(wěn)定性。通過分析可知，pH值對酶活力的影響主要體現(xiàn)為其對酶的活性條件及空間結(jié)構(gòu)具有破壞性。pH值過高會使酶失去活性，導(dǎo)致添加劑的使用效果下降。由圖4可知，當(dāng)pH值在3.8～4.2區(qū)間內(nèi)，溶液的澄清度隨著pH值的增加而上升。此區(qū)間后，溶液的澄清度逐漸下降。因此，添加劑使用的pH值最佳取值區(qū)間為3.8～4.2。

圖4 食品pH值對果膠酶使用效果影響測定結(jié)果Fig.4 The determination results of food pH values on pectinase usage

3.3 果膠酶處理時(shí)間對其使用效果影響分析

隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，添加劑與食品樣本完全反應(yīng)后，食品樣本的澄清度不再發(fā)生變化。由圖5可知，在15～60 min內(nèi)，樣本的澄清度隨著時(shí)間的增加而變化。45 min后液體的澄清速度逐漸下降，變化綜合考慮，最佳反應(yīng)時(shí)間在15～45 min。

圖5 果膠酶處理時(shí)間對其使用效果影響測定結(jié)果Fig.5 The determination results of pectinase treatment time on its use effect

3.4 果膠酶處理溫度對其使用效果影響分析

在添加劑的使用過程中，溫度與時(shí)間對其使用效果具有密切的關(guān)系。由于添加劑中酶蛋白的變性隨時(shí)間變化而改變，因此，在溫度變化初始階段，酶蛋白的變性尚未顯示出來。隨著溫度的逐漸提升，其反應(yīng)活性逐漸下降。由圖6可知，添加劑在溫度的變化中，其曲線趨勢呈現(xiàn)“凸”形。對圖像進(jìn)行分析可以看出，當(dāng)溫度在35～40 ℃時(shí)，添加劑活性最佳。當(dāng)溫度過高時(shí)，添加劑中的酶蛋白活性逐漸喪失，導(dǎo)致食品樣本中的固體物含量逐漸增加。

圖6 果膠酶處理溫度對其使用效果影響測定結(jié)果Fig.6 The determination results of pectinase treatment temperature on its use effect

3.5 果膠酶添加量對其使用效果影響分析

在食品添加劑與食品樣本作用過程中，當(dāng)樣本濃度大于食品添加劑濃度時(shí)，添加劑被食品樣本飽和，其反應(yīng)作用會隨著添加劑酶濃度的增加而增加。由圖7可知，添加劑的使用效果隨著果膠酶濃度的增加而增加。當(dāng)添加劑酶濃度為14～700 U/mL時(shí)，食品樣本溶液的透光性逐漸提升。綜合上述分析可以看出，食品添加劑酶濃度最佳區(qū)間為14～700 U/mL。

圖7 果膠酶添加量對其使用效果影響測定結(jié)果Fig.7 The determination results of pectinase additive amount on its use effect

3.6 果膠甲酯酶類添加劑加工工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)以上果膠甲酯酶類添加劑單因素應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，以此確定果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的最佳使用方案，見表3。

表3 果膠甲酯酶類添加劑用量水平表Table 3 The additive amount of pectin methylesterase additive

根據(jù)以上設(shè)定得到復(fù)合飲料配方正交試驗(yàn)結(jié)果,見表4。

表4 果膠甲酯酶類添加劑正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The orthogonal test results of pectin methylesterase additive

續(xù) 表

由表4可知，影響食品添加劑使用效果影響順序?yàn)锳>B>D>C，即添加劑用量>作用時(shí)間>pH值>溫度。同時(shí)確定其最佳配比為A3B3C2D2，即添加劑酶用量為75.20 U/mL，反應(yīng)時(shí)間為45 min，反應(yīng)溫度為38 ℃，食品pH值為4.0。

使用上述方案得到樣本的透光率為88.0%，證明此方案的使用效果最佳。將此方案應(yīng)用于食品加工中可有效提升食品加工效果。

4 結(jié)論

此次研究以果膠甲酯酶類添加劑作為研究對象，研究其制取過程以及在食品加工過程中的應(yīng)用效果。選擇食品樣本pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和酶添加量作為單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的測定對象，由此得出果膠甲酯酶類添加劑最佳制備工藝及使用條件。由多輪試驗(yàn)結(jié)果可知，果膠甲酯酶類添加劑最佳使用工藝為添加劑酶用量為75.20 U/mL，反應(yīng)時(shí)間為45 min，反應(yīng)溫度為38 ℃，食品pH值為4.0。將此研究結(jié)果作為添加劑的使用方式，可擴(kuò)大果膠甲酯酶類添加劑在食品加工中的應(yīng)用范圍，提升食品添加劑領(lǐng)域的研究深度。