乳制品中堿性磷酸酶檢測(cè)的影響因素及控制措施

周 玲，徐廣新

1 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，江蘇南京 210046

2 揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇揚(yáng)州 225004

關(guān)鍵字：堿性磷酸酶（ALP）；乳脂肪；復(fù)活

0 引言

堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）廣泛存在于自然界中，它是一種分子質(zhì)量為187 kDa的蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)為5.4～6.0[1]。生物體內(nèi)各組織和器官都含有ALP，ALP在生物體內(nèi)主要參與一些脫磷酸反應(yīng)，它的活性是生物體內(nèi)一個(gè)重要的生理評(píng)估指標(biāo)。牛奶中也含有大量的ALP，由于其熱穩(wěn)定性略高于乳中的大部分致病微生物，比如結(jié)核桿菌、李斯特菌等，因此，將其作為巴氏殺菌熱處理評(píng)估的活性指標(biāo)。當(dāng)牛奶熱處理強(qiáng)度足以使ALP活性檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，則說明其他病原微生物也被完全滅活，因此，ALP的活性指標(biāo)是乳制品加工業(yè)里非常重要的指標(biāo)，標(biāo)志著乳制品巴氏殺菌的成功與否。但牛奶微生物所含有的ALP可能會(huì)造成檢測(cè)假陽性現(xiàn)象或干擾測(cè)試結(jié)果。另外，不同品種奶牛、不同地域、牛奶中初始濃度、檢測(cè)溫度、脂肪含量等因素均會(huì)對(duì)牛奶巴氏殺菌后的檢測(cè)結(jié)果有影響。本文綜合闡述相關(guān)研究，提出控制措施，以對(duì)生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的異常情況進(jìn)行指導(dǎo)。

1 不同品種牛奶成分的一般差異

牛奶成分不同取決于品種（如奶牛、水牛、牦牛）、不同時(shí)期（哺乳期、乳房感染期）、喂養(yǎng)條件、環(huán)境條件等因素。由表1可知，奶?？偢晌镔|(zhì)含量顯著低于水牛和牦牛，這主要由于牛奶中總酪蛋白和脂肪含量均小于水牛奶和牦牛奶。ALP易富集于脂肪球膜上，脂肪含量對(duì)后期ALP檢測(cè)具有重要影響，最終導(dǎo)致奶牛中的原料乳ALP水平顯著低于水牛乳和牦牛乳。

表1 不同品種奶牛主要乳成分表[2]

2 乳脂肪的影響

ALP很容易被脂肪球吸收，因此，產(chǎn)品中的脂肪含量會(huì)影響最終檢測(cè)結(jié)果。產(chǎn)品中脂肪含量越高，終產(chǎn)品ALP水平越高。另外，通過對(duì)奶牛中ALP水平的檢測(cè)變化，也證實(shí)了其本身與乳脂球膜具有相關(guān)性。后期，通過對(duì)生鮮乳進(jìn)行脫脂處理工藝，發(fā)現(xiàn)了脫脂后的生鮮乳ALP水平顯著低于全脂生鮮乳，脫脂乳中ALP水平分別為全脂生鮮乳和奶油中ALP水平的47.0%和5.0%。研究表明，將巴氏殺菌處理后的生鮮乳ALP限值控制在350 mU/L以下才能滿足相關(guān)要求[3]。

3 干擾化合物的影響

目前ALP的檢測(cè)方法主要包括電化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、比色法、熒光法、色譜法等[4]。對(duì)于當(dāng)前巴氏殺菌乳中ALP快速檢測(cè)通常采用熒光法進(jìn)行比色分析，基于苯酚和其衍生物的方法進(jìn)行讀數(shù)，但易受到有色乳制品（如草莓乳）的干擾。此外，生鮮乳中土霉素和青霉素的抗生素殘留物會(huì)造成比色法中假陽性結(jié)果，也可能是生鮮乳中含有活性酚基成分或添加劑造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。同時(shí)，生鮮乳中類黃酮、糖類、抗壞血酸等成分也會(huì)抑制ALP活性，并造成檢測(cè)結(jié)果偏低。ALP的熱穩(wěn)定性也會(huì)受到氯化鈉和乳糖的影響，其中氯化鈉會(huì)降低生鮮乳中ALP的熱穩(wěn)定性，而乳糖會(huì)增加ALP的熱穩(wěn)定性，并影響巴氏殺菌處理效果及ALP檢測(cè)水平[5]。

4 微生物ALP的影響

除了牛奶內(nèi)源ALP，牛奶中還存在微生物ALP，當(dāng)進(jìn)行巴氏殺菌乳中ALP檢測(cè)時(shí)，有可能因?yàn)槲⑸镌碅LP而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。這些微生物源ALP的熱穩(wěn)定性要強(qiáng)于牛奶內(nèi)源ALP，造成內(nèi)源與微生物源的ALP難以區(qū)分。生產(chǎn)過程存在的微生物可能產(chǎn)生微生物磷酸酶和其他可能干擾殘留磷酸酶測(cè)試的物質(zhì)，這就導(dǎo)致生鮮乳經(jīng)過不同時(shí)間貯存后，其初始ALP水平會(huì)發(fā)生變化。目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無法直接區(qū)分內(nèi)源和微生物源的ALP，若巴氏殺菌乳ALP水平較高，取一部分樣品重新巴氏殺菌處理后ALP水平?jīng)]有明顯降低，這可能是微生物ALP的存在影響了最終的檢測(cè)結(jié)果，這主要是由于微生物ALP耐熱性能要高于生鮮乳中存在的ALP[6]。

5 ALP復(fù)活

ALP在一定條件下可以恢復(fù)活性，簡(jiǎn)稱ALP復(fù)活。Peereboom[7]在1940年首次觀察到，盡管剛滅菌處理后的高溫滅菌乳（UHT）中的ALP可能檢測(cè)為陰性，但隨后在儲(chǔ)存的UHT牛奶中ALP檢測(cè)結(jié)果可能為陽性。而Wright等[8]發(fā)現(xiàn)初始檢測(cè)呈陰性的巴氏殺菌乳在經(jīng)過22.0～37.0 ℃保存后，ALP結(jié)果又重新呈現(xiàn)陽性，并推斷ALP的復(fù)活與乳制品巴氏殺菌過程的溫度、時(shí)間以及運(yùn)輸儲(chǔ)存的溫度時(shí)間條件并沒有明顯的線性關(guān)系，并且與乳制品中乳脂含量和抗壞血酸含量沒有特異性關(guān)系。Lorenzen等[9]發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存148 天的UHT牛奶中，3.5%全脂乳中的ALP活性從20 mU/L增加到454 mU/L，1.5%低脂乳中的ALP活性從80 mU/L增加到3 248 mU/L，并發(fā)現(xiàn)高于71.7 ℃的溫度下進(jìn)行巴氏殺菌的牛奶更容易發(fā)生ALP復(fù)活。對(duì)于ALP的復(fù)活造成的假陽性結(jié)果，在待確認(rèn)的陽性樣品中加入含鎂離子的溶液，經(jīng)過相應(yīng)溫度和時(shí)間的培養(yǎng)，再次檢測(cè)ALP活性，當(dāng)測(cè)定結(jié)果不發(fā)生變化或者增強(qiáng)時(shí)，則可認(rèn)為該陽性結(jié)果為復(fù)性造成的假陽性結(jié)果[3]。

6 控制措施

6.1 加強(qiáng)人員培訓(xùn)

積極組織檢驗(yàn)人員對(duì)于《T/TSSTIA 008-2019巴氏殺菌乳中堿性磷酸酶活性的測(cè)定 發(fā)光法》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行學(xué)習(xí)，并制定ALP活性檢測(cè)的操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)人員的操作規(guī)范性，通過對(duì)巴氏殺菌乳在同一時(shí)間內(nèi)的ALP檢測(cè)結(jié)果判定消毒效果，確保產(chǎn)品合格，避免假陽性或ALP復(fù)活對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的干擾。另外，定期組織檢驗(yàn)人員參加北京奶業(yè)創(chuàng)新聯(lián)盟舉辦的培訓(xùn)活動(dòng)，提升關(guān)鍵崗位人員的檢驗(yàn)水平。

6.2 優(yōu)選檢驗(yàn)設(shè)備

目前巴氏殺菌乳ALP檢測(cè)通常采用熒光法快速檢測(cè)，采用國(guó)內(nèi)外公司在售的試劑管和配套檢測(cè)儀器，但不同型號(hào)設(shè)備間的準(zhǔn)確度和精密度存在差異，后期應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，企業(yè)應(yīng)對(duì)巴氏殺菌乳成品進(jìn)行上機(jī)測(cè)試及驗(yàn)證，確保檢驗(yàn)設(shè)備靈敏度符合優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳要求。

6.3 做好比對(duì)工作

對(duì)不同批次的試劑進(jìn)行比對(duì)校準(zhǔn)，對(duì)不同檢驗(yàn)員的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行不定期交叉比對(duì)，保證檢驗(yàn)結(jié)果的可信度。一方面與其他檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行溝通，充分利用質(zhì)檢所和第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的合作關(guān)系，開展檢驗(yàn)項(xiàng)目比對(duì)，確保檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性高。另一方面實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部2名檢驗(yàn)員進(jìn)行同時(shí)檢驗(yàn)，嚴(yán)格按照檢驗(yàn)規(guī)范，明確檢驗(yàn)項(xiàng)目，填寫比對(duì)記錄，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

6.4 建立實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫

針對(duì)生鮮乳指標(biāo)的差異性，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況建立ALP檢測(cè)結(jié)果與脂肪含量和其他干擾物質(zhì)間的相關(guān)性，有利于對(duì)異常數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。這主要由于實(shí)驗(yàn)室涉及人員較多、設(shè)備種類也比較復(fù)雜、來樣檢驗(yàn)品種較多，因此在管理上必須采取規(guī)范的制度才能確保所有檢驗(yàn)結(jié)果完備齊全，不僅為人員、設(shè)備、檢驗(yàn)資料的管理提供基礎(chǔ)，也為日常生鮮乳及巴氏殺菌乳制品的產(chǎn)品穩(wěn)定性提供數(shù)據(jù)支撐。

6.5 加強(qiáng)信息溝通

做好牧場(chǎng)信息飼養(yǎng)情況精準(zhǔn)對(duì)接，以利于對(duì)ALP數(shù)據(jù)異常系統(tǒng)分析。由于檢驗(yàn)結(jié)果可能受到假陽性結(jié)果的干擾，因此存在檢驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際不相吻合，容易造成檢驗(yàn)員的檢驗(yàn)水平受到質(zhì)疑，如果與牧場(chǎng)或加工環(huán)節(jié)不能進(jìn)行很好的溝通，不僅給奶源基地和加工廠造成不合格品處置造成的損失及浪費(fèi)。只有檢驗(yàn)部門與加工和奶源基地建立起良好的溝通機(jī)制，才有利于提高檢驗(yàn)質(zhì)量。