規(guī)?；膛鰻倥８篂a的病原檢測與分析報(bào)告

阮繼湘，劉文曉，江 波，許 健，李永清，程 晶＊

1 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070

2 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097

0 引言

隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)發(fā)展，犢牛腹瀉病的發(fā)生呈上升趨勢。引起該病的原因很多，主要分為感染性和非感染性。若沒有及時(shí)找到病因進(jìn)行有效治療，則會影響新生犢牛的生長和繁育，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，對患病犢牛做出及時(shí)準(zhǔn)確的診斷和治療，可以保證牛只健康，促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

2021年入夏以來，收到內(nèi)蒙古某規(guī)?；膛雠Ｈ撼霈F(xiàn)犢牛腹瀉病況的報(bào)告。患病牛涉及1～6 月齡犢牛，牧場256頭犢牛中，20 頭出現(xiàn)腹瀉癥狀。主要癥狀是持續(xù)腹瀉20 多天，糞便呈黃綠色水樣，部分犢牛糞便中帶有血液和黏液。大部分出現(xiàn)脫水和衰弱；體溫38.8～39.3 ℃；聽診心跳快，肺部濕羅音，瘤胃處有鋼管音。曾以頭孢嘧啶和恩諾沙星治療，但效果不佳，并出現(xiàn)了3 頭牛死亡，約占發(fā)病牛的15.00%。為查明腹瀉發(fā)生和流行的原因，對腹瀉犢牛的血液和糞便進(jìn)行細(xì)菌、病毒和寄生蟲的病原學(xué)和核酸檢測，對腹瀉犢牛血清進(jìn)行病毒抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 病料

對腹瀉犢牛進(jìn)行現(xiàn)場采樣，采集腹瀉犢牛血液及血清樣品各20 份。直腸糞便采樣，收集水樣糞樣6個(gè)，稀便糞樣3 個(gè)，共計(jì)9 個(gè)糞樣。

1.2 血清抗體檢測

用牛副結(jié)核、牛病毒性腹瀉/黏膜病酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）檢測試劑盒（IDEXX公司）分別檢測牛副結(jié)核分枝桿菌抗體以及牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗體，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行；同時(shí)以病毒中和試驗(yàn)檢測牛輪狀病毒和冠狀病毒抗體。

1.3 細(xì)菌分離鑒定

選擇腹瀉癥狀嚴(yán)重的病牛直腸糞便，以Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基（一種專門用于空腸彎曲桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和短期保存的培養(yǎng)基）保存運(yùn)輸。取少量樣品直接劃線接種于麥康凱平板用于大腸桿菌的分離；進(jìn)而利用沙門氏菌專用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液進(jìn)行37.0 ℃過夜培養(yǎng)，增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色鑒別培養(yǎng)瓊脂平板，用于沙門氏菌的分離培養(yǎng)；最后利用Bolton肉湯于微需氧產(chǎn)氣袋的厭氧罐中37.0 ℃過夜培養(yǎng)，將增菌液劃線接種于彎曲桿菌選擇培養(yǎng)基（CCDA平板），于37.0 ℃厭氧罐中培養(yǎng)48 h。挑取生長一致的單個(gè)菌落涂片鏡檢并進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定。

彎曲菌三重PCR鑒定：取疑似彎曲菌培養(yǎng)菌液0.5 mL，離心后去除上清液，菌沉淀加入50.0 μL純水重懸，煮沸5 min，離心后取上清液用于三重PCR檢測。三重PCR檢測方法參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行，即同時(shí)擴(kuò)增彎曲菌屬16S rRNA基因（857 bp）、空腸彎曲菌mapA基因（589 bp）和結(jié)腸彎曲菌ceuE基因（462 bp）。

1.4 寄生蟲卵檢測

取腹瀉犢牛糞便約10.0 g，加飽和食鹽水100.0 mL混勻，通過60 目銅網(wǎng)過濾于小燒杯中，立即吸取濾液至小青瓶中形成凸面，靜置30 min后，以清潔載玻片輕觸液面于顯微鏡下檢查蟲卵[3]。

1.5 病毒檢測

分別取磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的糞便上清以及血液樣品200.0 μL，使用病毒/細(xì)菌核酸柱式提取試劑盒提取樣品核酸（北京森康生物技術(shù)有限公司）。使用牛病毒性腹瀉熒光RT-PCR檢測試劑盒（北京森康生物技術(shù)有限公司）檢測牛病毒性腹瀉病毒。將提取的樣品核酸反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行輪狀病毒VP6基因以及牛冠狀病毒N基因PCR擴(kuò)增，檢測引物[生物工程（上海）股份有限公司合成]見表1[2]。25.0 μL PCR反應(yīng)體系如下：2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，擴(kuò)增樣本cDNA/DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94.0 ℃，2 min；94.0 ℃，30 s；55.0 ℃，30 s；68.0 ℃，40 s；68.0 ℃，5 min，40 個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠核酸電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

表1 檢測牛冠狀病毒及輪狀病毒的引物序列

2 結(jié)果

2.1 血清抗體檢測

對所采集的20 份腹瀉犢牛血清進(jìn)行腹瀉相關(guān)病原的ELISA檢測。結(jié)果表明，所有樣品的牛副結(jié)核桿菌抗體均為陰性，牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗體陽性率為65.00%；病毒中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛輪狀病毒抗體陽性率25.00%，而牛冠狀病毒抗體15.00%。

2.2 致病性細(xì)菌分離鑒定

對收集的9 份牛直腸糞便，進(jìn)行不同菌落的形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)以及16sRNA PCR鑒定。PCR結(jié)果未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌和腸炎沙門氏菌等與下痢相關(guān)的致病菌株，但41號及57號牛直腸糞便樣品在彎曲菌選擇培養(yǎng)基CCDA上生長菌落，經(jīng)彎曲菌三重PCR鑒定，其中1 株為結(jié)腸彎曲桿菌，另1 株為空腸彎曲桿菌（圖1）。

圖1 牛彎曲菌三重PCR 鑒定結(jié)果

2.3 寄生蟲卵檢測

對收集的9 份牛直腸糞便進(jìn)行鏡檢，7 份糞樣中發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊，球蟲卵囊檢出率達(dá)77.78%。同時(shí)，含有球蟲卵囊的糞樣中，有1 份糞樣發(fā)現(xiàn)蛔蟲卵，2份糞樣發(fā)現(xiàn)其他線蟲卵。

2.4 病毒檢測

針對牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、輪狀病毒以及冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的檢測結(jié)果表明，在20份牛血液和9 份糞便樣品中，57號牛血液及糞便樣品為牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒核酸檢測陽性，糞便樣品中牛冠狀病毒核酸檢測陽性；此外，9號牛的糞便中檢測到牛冠狀病毒；28號牛的糞便樣品同時(shí)檢測到輪狀病毒和牛冠狀病毒；41號牛的血液樣品中檢測到牛冠狀病毒，糞便樣品中含有牛輪狀病毒；55號牛的糞便樣品中則含有牛冠狀病毒（圖2）。

圖1 牛彎曲菌三重PCR 鑒定結(jié)果

3 分析與討論

犢牛腹瀉是規(guī)?；膛龀Ｒ姷囊环N消化系統(tǒng)疾病，一年四季均可發(fā)生。主要表現(xiàn)為急性或慢性下痢，不僅使奶牛的抵抗力變差，生長緩慢甚至引起死亡。調(diào)查資料表明，規(guī)?；膛龅臓倥８篂a在斷奶前后的患病率和發(fā)病率通常分別為3.0%和0.5%，而本次牛場暴發(fā)的犢牛腹瀉率為7.81%，遠(yuǎn)高于目前的平均發(fā)病率。

該病在不同時(shí)期存在不同的病因，一般可以分為營養(yǎng)性腹瀉和傳染性腹瀉。營養(yǎng)性腹瀉是由于營養(yǎng)因素和飼養(yǎng)管理不當(dāng)而造成的消化不良，可以通過改變喂飼方式而改善；但傳染性腹瀉的致病因素比較復(fù)雜，包括牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、冠狀病毒、輪狀病毒等病毒，也可能因腸炎沙門氏菌、產(chǎn)毒型大腸桿菌、空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲菌引起。從實(shí)驗(yàn)室收集的病料檢測結(jié)果來看，未發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌以及產(chǎn)毒型大腸桿菌，可能與病牛接受了抗菌藥物治療有關(guān)。但牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒，空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲菌，牛球蟲等病原感染嚴(yán)重，尤其是與腹瀉相關(guān)的病毒，如牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀腹瀉病毒等，不僅存在于腹瀉犢牛的糞便中，甚至引發(fā)了病毒血癥，因此，多病原同時(shí)感染或繼發(fā)感染是規(guī)?；膛隽餍行誀倥８篂a的主要因素。

這些病原體的感染和致病與氣候潮濕、多雨造成牛場污穢的環(huán)境密切相關(guān)。夏季正是奶牛腹瀉的高發(fā)和流行時(shí)期，奶牛場需要對該病高度重視。一是確保牛舍干凈的環(huán)境衛(wèi)生和通風(fēng)條件，并采取嚴(yán)格消毒等綜合防控措施；二是定期對全群牛進(jìn)行血清學(xué)檢查，及時(shí)掌握病毒在牛群中的流行狀況，發(fā)現(xiàn)陽性牛，要堅(jiān)決隔離、淘汰，以防疫情擴(kuò)大；三是要做好牛只的定期驅(qū)蟲工作，以免球蟲等寄生蟲感染破壞牛腸上皮細(xì)胞造成繼發(fā)感染。

治療腹瀉，補(bǔ)液是關(guān)鍵。腹瀉發(fā)生時(shí)即灌服畜禽專用營養(yǎng)補(bǔ)液鹽，能有效緩解腹瀉牛出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)失衡和酸中毒等，同時(shí)應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，使用敏感抗生素進(jìn)行治療。針對此次疫情中分離的牛彎曲菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，篩選到具有高度抑菌作用的馬坡沙星等喹諾酮藥物，治療效果明顯。目前，我國已有牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗上市，建議對感染嚴(yán)重的牛群實(shí)施預(yù)防接種。