植物乳桿菌的添加對腌制鲅魚加工貯藏過程中生物胺的抑制效果研究

◎ 朱容新，何 璇，馬 堃，李婷婷

（大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600）

鲅魚，學名“藍點馬鮫”，肉質(zhì)細膩嫩滑，味道鮮美，是我國渤海、黃海海域最主要的經(jīng)濟魚類之一[1]。鲅魚中富含的脂肪和蛋白質(zhì)使其具有獨特的膠質(zhì)口感，可制成魚丸、魚肝油等多樣魚制品，一直深受消費者喜愛。由于捕撈洄游性魚類受季節(jié)因素影響，且加工貯藏過程中魚肉極易感染微生物引起腐敗變質(zhì)，因此延長鲅魚保鮮期至關重要[2]。生物胺（Biogenic Amine，BA）是由微生物在活細胞內(nèi)氨基酸脫羧過程中產(chǎn)生的天然化合物，大量積累時可引起不良生理效應，如引起人體胃和腸道問題、偏頭痛、心悸等現(xiàn)象[3]。食品中組胺是主要形成的胺，其毒性最強，具有直接的致病性和生理毒性，其次是尸胺、酪胺和腐胺，DEL等[4]認為尸胺和腐胺可以增強組胺的毒性，因此生物胺可作為鲅魚的化學質(zhì)量指標用于監(jiān)測食品質(zhì)量。

植物乳桿菌（L.P）是一種常見的同型發(fā)酵乳酸菌，廣泛分布在植物、發(fā)酵食品和人體中，具有良好的益生效果，因此在食品、醫(yī)療、畜牧業(yè)等領域被廣泛應用[5]。近年來，通過添加發(fā)酵劑來抑制不同發(fā)酵肉制品中生物胺的積累已有研究。NIE等[6]發(fā)現(xiàn)含有植物乳桿菌和釀酒酵母的胺陰性混合發(fā)酵劑可降低發(fā)酵鰱魚香腸中的腐胺和尸胺含量。AMONLAYA等[7]將植物乳桿菌作發(fā)酵劑接種在泰國發(fā)酵豬肉香腸中從而抑制生物胺的積累，提高了發(fā)酵香腸的衛(wèi)生質(zhì)量。

本實驗將植物乳桿菌接種在濕腌法腌制的鲅魚中，植物乳桿菌可誘導環(huán)境快速酸化，從而減少腌制過程中形成的生物胺?？剂縫H對腌制鲅魚中細菌生長的抑制性、魚肉保鮮的各項指標，以及在此過程中生物胺的積累，以期探查植物乳桿菌對腌制鲅魚中生物胺積累的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鲅魚：購于大連市開發(fā)區(qū)樂購超市，條重1.0 kg左右；生物胺標準品（色譜純）：色胺（Try）、腐胺（Put）、尸胺（Cad）、組胺（His）、酪胺（Tyr）；其他試劑（AR）：10.0 mg·mL-1丹磺酰氯丙酮溶液、5%三氯乙酸溶液、正己烷、2.0 mol·L-1NaOH溶液、飽和NaHCO3溶液、氨水、6.0 mol·L-1鹽酸溶液、氮氣、0.2 mol·L-1鹽酸溶液、PCA平板計數(shù)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、0.5 mol·L-1硼酸溶液、0.01 mol·L-1鹽酸標準滴定溶液、飽和K2CO3溶液、混合指示劑（甲基紅、亞甲基藍配比為2∶1）、混合氨基酸標準溶液；實驗用水均為屈臣氏純凈水。

1.1.2 儀器與設備

LC-20AB型高效液相色譜儀（日本島津公司）、2010Plus型氣相質(zhì)譜儀（日本島津公司）、L-8900型高速氨基酸分析儀（日立公司）、HVE-50型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、T-25型粉碎機（德國IKA）、DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、BR4i型高速冷凍離心機（法國JOUAN）。

1.1.3 樣品預處理

將新鮮鲅魚剔除頭尾、內(nèi)臟和魚骨，清水沖洗后放入盆中，加入質(zhì)量為魚體質(zhì)量17%的食鹽，層魚層鹽涂抹均勻。將鲅魚分為4組，每組500 g，分別用1×105CFU·g-1、1×106CFU·g-1、1×107CFU·g-13種濃度的L.P懸浮液以及相同體積的無菌生理鹽水溶液處理（記：5、6、7、CK）。腌制24 h后取出用清水沖洗脫鹽2次，置于烘箱30 ℃烘干，保留魚體水分約為30%，取出稱重并裝入自封袋室溫待用。在第0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d對腌制鲅魚進行抽樣測定。

1.1.4 實驗流程圖

研究乳桿菌在鲅魚腌制過程對生物胺的影響，實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程圖

1.2 檢測指標及實驗方法

1.2.1 腌制鲅魚理化指標的測定

（1）pH值的檢測方法。參照FAN等[8]的方法，取2.0 g樣品于20.0 mL蒸餾水中，攪拌30 min后過濾，濾液備用，用pH計測量。

（2）TVBN的檢測方法。參照GB 5009.228—2016食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定中微量擴散法。

（3）菌落總數(shù)的檢測方法。參照GB 789.2—2016食品微生物學檢驗中菌落總數(shù)測定方法。

1.2.2 腌制鲅魚生物胺含量的測定

（1）測定方法。參照GB 5009.208—2016食品中生物胺的測定方法。

（2）色譜條件及計算。色譜柱：Waters C18（150 mm×4.6 mm×5 μm，0.01 μm）；柱溫40 ℃；流速0.8 mL·min-1；進樣量20 μL；紫外檢測波長：245 nm；A相純凈水；B相乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

樣品中生物胺含量按公式（1）計算：式中：X，樣品中生物胺的含量，mg·kg-1或mg·L-1；c，樣品溶液中生物胺的濃度，mg·L-1；V，樣品溶液體積，mL；f，稀釋倍數(shù)；m，樣品的質(zhì)量，g。

1.2.3 腌制鲅魚氨基酸含量的測定

參照GB 5009.124—2016食品中氨基酸的測定。

1.2.4 腌制鲅魚揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

（1）測定方法。采用李婷婷等[9]的方法，稱量2.0 g研碎后的魚肉放入頂空瓶中，將萃取頭（75 μm CAR/PDMS）通過隔膜插入頂空部分，60 ℃水浴條件下吸附40 min后取出，完成萃取過程。將吸附好的萃取頭取出，迅速轉(zhuǎn)移至氣相色譜進樣口內(nèi)，解析10 min。

（2）氣相質(zhì)譜條件。HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃；進樣口溫度250 ℃；氦氣流速0.81 mL·min-1；解析溫度250 ℃；不分離進樣；EI源230 ℃；四極桿150 ℃；電離電壓70 eV；掃描范圍30～550 m·z-1；氣相升溫程序見表2。

表2 氣相升溫程序表

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣品平行測定3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差。使用IBM SPSS Statistics 26進行數(shù)據(jù)差異性分析，使用Origin 2019 64Bit對數(shù)據(jù)繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 腌制鲅魚貯藏期間理化指標的變化

2.1.1 腌制鲅魚pH的變化

腌制鲅魚pH值的變化如圖2所示，在整個加工貯藏過程中pH都呈下降趨勢，在24 d時間內(nèi)CK、5、6、7組分別從初始pH值7.30、6.40、6.20、6.20下降至6.37、6.10、6.10、5.70，其中7組的pH值在第24 d達到最低值。CK的pH下降可歸因于魚肉中的肌糖原發(fā)生糖酵解產(chǎn)生乳酸；接種L.P菌種的腌制鲅魚pH值較CK低可歸因于菌種的存在以及菌種代謝產(chǎn)生其他碳水化合物。此結果與NIE等[6]研究植物乳桿菌和釀酒酵母菌接種的鰱魚香腸中pH的趨勢一致。

圖2 腌制鲅魚pH的變化圖

2.1.2 腌制鲅魚TVBN的變化

腌制鲅魚的腐敗水平是通過TVBN值來評價的，由于內(nèi)源酶和腐敗菌會分解魚肉中蛋白質(zhì)，產(chǎn)生具有揮發(fā)性的氨和胺類物質(zhì)，因此此類物質(zhì)含量越高，營養(yǎng)價值越差，通過測定TVBN，可以推測樣品的腐敗程度[10,11]。腌制鲅魚在貯藏期間的TVBN值變化如圖3所示，CK、5、6、7組的TVBN值均隨貯藏時間的延長而增加。其中，TVBN值在0～12 d儲存時緩慢增加，但在第12 d后觀察到TVBN值顯著增加（P＜0.05），這可歸因于隨著貯藏時間的延長揮發(fā)性物質(zhì)大量積累，促進魚肉迅速腐敗。接種L.P后腌制鲅魚TVBN的生成受到抑制，增長速度明顯慢于對照組，尤其是在第24 d，CK的TVBN值在第24 d為44.33 mg/100 g，而5、6、7組 的TVBN值 較CK分別下降了6.56%、21.05%和42.09%。因此，用1×107CFU·g-1的L.P處理腌制鲅魚，可得到較好的抑制TVBN增加的效果。這一趨勢與石建喜等[12]發(fā)酵鰱魚接種混合發(fā)酵劑的研究中TVBN的變化結果一致。

圖3 腌制鲅魚中TVBN的變化圖

2.1.3 腌制鲅魚菌落總數(shù)的變化

腌制鲅魚菌落總數(shù)變化如圖4所示。在0～12 d的過程中菌落總數(shù)計數(shù)增加，這可能是由于加工過程中L.P菌種的添加和自然貯藏過程中微生物的生長所致。在急劇上升后，第12 d計數(shù)以緩慢的速度開始下降，并最終穩(wěn)定在較高的水平，這可歸因于pH值的下降抑制了部分微生物的生長，魚肉迅速腐敗導致的污染物質(zhì)的增加以及營養(yǎng)耗盡[13]。CK組的最終計數(shù)為7.10 log CFU·g-1，而5、6、7組的菌落總數(shù)較CK組分別下降了16.90%、33.10%、34.23%。這可歸因于L.P產(chǎn)生抑制其他雜菌生長的細菌素，其中第24 d濃度為107CFU·g-1時的菌落總數(shù)4.67 log CFU·g-1，因此接種1×107CFU·g-1的L.P對腌制鲅魚的菌落總數(shù)抑制效果更強。

圖4 腌制鲅魚中菌落總數(shù)的變化圖

腌制鲅魚乳酸菌數(shù)的變化如圖5所示，整體趨勢與菌落總數(shù)一致，在0～12 d急速上升后計數(shù)以緩慢的速度下降，乳酸菌由于其對環(huán)境的強適應力和更快的生長速度成為主要的優(yōu)勢微生物。5、6、7組的乳酸菌數(shù)均顯著高于CK組，因此添加L.P可以促進乳酸菌產(chǎn)生乳酸誘導魚肉酸化，使魚肉的pH值大幅下降，從而抑制其他微生物如腐敗菌的生長。這與BOVER等[14]的研究結論一致。

圖5 腌制鲅魚過程中乳酸菌數(shù)的變化圖

2.2 腌制鲅魚貯藏期間生物胺含量的變化

2.2.1 生物胺檢測標準曲線

生物胺單胺的回歸方程及相關系數(shù)如表3所示。分 別 配 制10 mL 1.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、15.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1的生物胺標準溶液，采用HPLC對標準液進行分析。以濃度-峰面積繪制生物胺標準曲線，得到3種生物胺的回歸方程及其線性相關系數(shù)。從表3可以看出，3種生物胺的R2＞0.99。結果表明，該濃度與其峰面積呈良好的線性關系，為計算生物胺含量提供了可靠依據(jù)。

表3 生物胺單胺的回歸方程及系數(shù)表

2.2.2 腌制鲅魚生物胺的變化

腌制鲅魚中接種了不同濃度的L.P作為發(fā)酵劑培養(yǎng)物，并通過HPLC分析了不同組別中的生物胺含量變化。經(jīng)過24 d后，如圖6（a）所示，CK、5、6、7組尸胺濃度分別從最初的4.85 mg·kg-1、4.26 mg·kg-1、5.20 mg·kg-1、4.95 mg·kg-1增加到27.41 mg·kg-1、25.65 mg·kg-1、23.57 mg·kg-1、20.96 mg·kg-1；5、6、7組中尸胺含量比CK組降 低6.42%、14.01%、23.53%。如 圖6（b）所 示，腐胺 濃 度分 別 從最初 的5.64 mg·kg-1、5.84 mg·kg-1、6.51 mg·kg-1、4.08 mg·kg-1增加到25.55 mg·kg-1、22.60 mg·kg-1、20.92 mg·kg-1、18.25 mg·kg-1；5、6、7中腐胺含量比CK組降低11.55%、18.12%、28.57%。如圖6（c）所示，組胺濃度分別從最初的4.54 mg·kg-1、4.32 mg·kg-1、4.89 mg·kg-1、4.38 mg·kg-1增 加 到65.79 mg·kg-1、62.22 mg·kg-1、60.99 mg·kg-1、56.34 mg·kg-1；5、6、7中組胺含量比CK組降低5.43%、7.30%、14.36%，這與ESSID等[15]研究生物胺在香腸中高度積累的趨勢一致。如圖6（d）所示，貯藏過程中接種組的總生物胺濃度明顯低于CK組，5、6、7組在第24 d總生物胺含量為110.47 mg·kg-1、105.48 mg·kg-1、95.55 mg·kg-1，均低于CK組118.75 mg·kg-1，分別降低6.97%、11.17%、19.54%，說明接種濃度為1×107CFU·g-1時更能有效地抑制生物胺的積累。

圖6 腌制鲅魚中生物胺含量的變化圖

綜合各項指標分析，接種L.P腌制鲅魚pH值降低，導致腐敗菌及堿性含氮物質(zhì)的生成受到抑制，并且抑制胺陽性菌的生長，L.P與其他含有氨基酸脫羧酶的微生物競爭，抑制其生長與脫羧活性從而減少生物胺的積累。此外，L.P含有的生物胺氧化酶可降解貯藏過程中形成的生物胺[16]。

2.3 腌制鲅魚貯藏期間氨基酸含量的變化

腌制鲅魚中生物胺的產(chǎn)生與氨基酸的存在有關。如表4所示，發(fā)酵24 d后4個濃度批次中的氨基酸含量均顯著減少。氨基酸的釋放是內(nèi)源性酶和微生物酶的蛋白水解作用的結果。發(fā)酵結束時，CK組氨基酸總量為9.69 mg/100 g，5、6、7組游離氨基酸總量分別為7.28 mg/100 g、15.21 mg/100 g、6.13 mg/100 g。與CK組相比，6中氨基酸含量較高，而5、7中含量較低。導致氨基酸含量的差異可能是由pH值引起的，pH值會影響鲅魚魚肉中蛋白質(zhì)的降解。賴氨酸、鳥氨酸和組氨酸分別是尸胺、腐胺和組胺的前體物質(zhì)，但L.P抑制了其他含有氨基酸脫羧酶的微生物生長及脫羧酶活性，因此本研究認為游離氨基酸含量與生物胺積累量無顯著相關性，影響脫羧酶活性的因素可能比氨基酸更重要。同樣，HU等[17]也描述了氨基酸含量和生物胺積累沒有顯著相關性。

氨基酸影響腌制鲅魚的營養(yǎng)價值與風味，如表4所示，在第24 d必需氨基酸分別占總氨基酸含量的49.53%、55.63%、50.95%、49.10%，保證適當食用腌制鲅魚能夠?qū)C體攝入氨基酸提供幫助，另外獨特的氨基酸風味可中和乳酸引起的酸味，使魚肉的口感更佳，甜味主要源于蘇氨酸和甘氨酸，苦味主要源于甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和精氨酸[18-20]，綜上所述，接種濃度為1×107CFU·g-1的腌制鲅魚甜味較高而苦味酸味較低，具有更豐富的風味。

2.4 腌制鲅魚貯藏期間揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

腌制鲅魚過程中揮發(fā)性風味化合物的種類及數(shù)量如圖7所示，通過比較峰面積對風味化合物的變化進行半定量分析。第0 d共檢測到136種化合物，其中酸類占比8.82%，酯類占比19.12%，烯類占比14.71%，醇類占比22.06%，酚類占比1.47%，醛類占比33.82%；第24 d檢測到88種化合物，其中酸類占比10.23%，酯類占比18.18%，烯類占比11.36%，醇類占比20.46%，酚類占比2.27%，醛類占比37.50%。由圖7可以看出，第24 d的風味數(shù)量相較0 d較少，整體減少48種，這符合揮發(fā)性風味物質(zhì)的趨勢，均為前期鮮味豐富，后期鮮味降低。

圖7 腌制鲅魚中揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類及數(shù)量圖

酸味是揮發(fā)性風味物質(zhì)中一類重要的風味化合物，乙酸作為乙酸酯的前體，被微生物反復利用轉(zhuǎn)化成具有香味的酯類，有助于鲅魚魚肉風味的增加[21]。醇類中1-戊烯-3-醇是天然食用香料，天然品主要來源于橙子、草莓等，1-辛烯-3-醇天然存在于薄荷、鮮蘑菇中。烯類化合物通常具有花草香和檸檬香等氣味，醛類如己醛、苯乙醛具有青草味及果香味，酚類由于量微不對風味產(chǎn)生影響。由圖7可得，醛類是腌制鲅魚中數(shù)量最多的揮發(fā)性化合物。其中，己醛、庚醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇是主要的魚腥味來源物質(zhì)。CK、5、6、7組的魚腥味物質(zhì)總量分別為31.21%、9.17%、11.91%、10.4%，其中己醛占魚腥味物質(zhì)的41.75%、16.58%、18.72%、8.65%，CK組的己醛含量最高，魚腥味更重，7中的魚腥味物質(zhì)占比最低，證明添加1×107CFU·g-1L.P后對鲅魚魚腥味抑制效果最好。

3 結論

本次實驗結果表明了腌制鲅魚加工貯藏過程中3種生物胺的形成，確定了植物乳桿菌添加量與生物胺含量之間的抑制關系。結合各項指標得出結論，當添加植物乳桿菌濃度為1×107CFU·g-1時，pH由于乳酸菌的生長代謝產(chǎn)生乳酸使魚肉酸化而降低，同時pH的降低抑制其他好氧菌的生長，導致菌落總數(shù)減少，由內(nèi)源酶和腐敗菌受到抑制引起的TVBN值降低且魚肉沒有腐爛，生物胺的濃度最低證明1×107CFU·g-1抑制效果最強，同時還保證魚肉豐富的風味。

因此，1×107CFU·g-1的植物乳桿菌的添加可在最大程度上抑制腌制鲅魚加工貯藏過程中的生物胺形成，在保證其魚肉的風味營養(yǎng)與質(zhì)量的同時，延長腌制鲅魚的保質(zhì)期，對腌制鲅魚防腐保鮮方面具有良好的應用前景。