循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)估高齡中晚期非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的價(jià)值分析

趙瑩 李英姿 丁惠卿 呂克 張賀 孔悅

作者單位：徐州市中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 徐州 221009

國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2014年我國肺癌新發(fā)病例78.1 萬，位居全國癌癥發(fā)病首位，其中老年肺癌患者（>60 歲）占75.3%，大于80 歲的患者占14.2%[1]。2006～2011年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌在60～74 歲人群中的發(fā)病率最高（231.8/10 萬），其次是大于75 歲（138.4/10 萬），而大于75 歲的肺癌患者死亡率最高（432.4/10 萬）[2]。流行病學(xué)研究提示高齡老年（≥75 歲）肺癌的發(fā)病率及死亡率均居高不下，隨著中國社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快，老年肺癌的發(fā)病率還將逐年升高[1]。目前，非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）的靶向治療及免疫治療等領(lǐng)域研究成果頗多，但大部分臨床研究為了減少混雜因素的影響，都將高齡患者排除在外，高齡NSCLC 患者的臨床數(shù)據(jù)較少，對(duì)高齡NSCLC 患者的預(yù)后研究更是鮮有報(bào)道。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）是指由實(shí)體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[3]，獲取途徑相對(duì)無創(chuàng)、便捷、可重復(fù)，是研究高齡老年肺癌的理想研究對(duì)象。本研究旨在通過分析高齡中晚期NSCLC 患者的臨床資料，以探討外周血CTCs 水平對(duì)中晚期高齡老年NSCLC 患者的預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究收集2017年1月～2019年4月在我院住院治療（腫瘤內(nèi)科、胸外科、呼吸科）的高齡NSCLC 患者，均為保守治療（不再接受手術(shù)、放化療、靶向和免疫治療），NSCLC 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)原發(fā)性肺癌診療指南（2016.V1）。入組標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷確診為NSCLC，年齡≥75 歲，入組時(shí)TNM 臨床分期為Ⅲ或Ⅳ期。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的呼吸衰竭、心力衰竭及肝腎功能不全者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：在隨訪過程中再次選擇手術(shù)、放化療和（或）靶向及免疫治療等任一種積極治療方式者。收集所有患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙狀況、病理類型、臨床分期、血清腫瘤標(biāo)記物水平（CEA 和CA125）。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均簽署了知情同意書。

1.2 CTCs 檢測方法真空采血管采集靜脈血2ml于EDTA 抗凝管中。采用全自動(dòng)循環(huán)腫瘤活細(xì)胞捕獲系統(tǒng)（NEXTCTC，無錫納奧生物有限公司），利用CTC 核質(zhì)比大和腫瘤細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的物理特性，采用不依賴于抗體的納米微流控芯片自動(dòng)分選技術(shù)分選富集CTCs，利用免疫熒光原位雜交技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察，CEP8+（有3 個(gè)或者3 個(gè)以上熒光探針點(diǎn)）、DAPI+、CD45-判定為CTCs，并計(jì)數(shù)。根據(jù)外周血CTCs 檢出數(shù)目將NSCLC 患者分為3 組，陰性組（CTCs 計(jì)數(shù)<2 個(gè)），低負(fù)荷組（2 個(gè)≤CTCs 計(jì)數(shù)<5 個(gè)）和高負(fù)荷組（CTCs 計(jì)數(shù)≥5 個(gè)）。

1.3 觀察指標(biāo)主要研究指標(biāo)為NSCLC 患者中位生存期（單位以月計(jì)）、1年生存率、總生存率，隨訪方式包括住院記錄、電話隨訪、門診復(fù)診三種。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)及四分位間距表示[M（P25，P75）]，應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，行卡方檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan-Meier 法計(jì)算生存時(shí)間（中位生存期），應(yīng)用Log-rank 檢驗(yàn)單因素分析臨床資料對(duì)生存時(shí)間影響，將單因素分析中對(duì)生存時(shí)間有影響的因素應(yīng)用Cox 回歸模型進(jìn)行多因素分析。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 繪制生存曲線，采用Log-rank 法檢驗(yàn)生存曲線間差異。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者一般資料比較最終納入NSCLC 患者52 例，中位年齡78.5 歲，男38 例，女14 例。CTCs陰性組20 例，低負(fù)荷組19 例，高負(fù)荷組13 例。三組患者間性別、年齡及吸煙情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高負(fù)荷組病理類型中腺癌多見（P<0.05），低負(fù)荷組及高負(fù)荷組TNM 臨床分期更高（P<0.05）。陰性組與高負(fù)荷組相比， CA125 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），余腫瘤標(biāo)記物三組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 三組患者臨床基線資料比較

2.2 影響生存時(shí)間的單因素分析將年齡、性別、吸煙、病理類型、TNM 分期、血清CEA 水平、血清CA125 水平及外周血CTCs 水平納入生存時(shí)間單因素分析，結(jié)果顯示年齡、TNM 分期、血清CA125 水平及CTCs 水平影響老年中晚期NSCLC 患者的生存時(shí)間（P<0.05），見表2。而性別、吸煙、病理分型以及血清CEA 水平對(duì)老年中晚期NSCLC 患者的生存時(shí)間影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 影響高齡中晚期NSCLC 生存時(shí)間的單因素分析

2.3 影響生存時(shí)間的多因素分析多因素分析應(yīng)用Cox 回歸模型將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的年齡、TNM 分期、血清CA125 水平及CTCs 水平作為自變量進(jìn)行賦值，年齡:<80 歲=0；≥80 歲=1；TNM 分期：Ⅲ期=1；Ⅳ期=2;血清CA125 水平:<35U/ml=1；≥35U/ml=2；外周血CTCs 水平: 陰性組=1；低負(fù)荷組=2；高負(fù)荷組=3。結(jié)果顯示,外周血CTCs 水平是影響生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素（P<0.05），比值比為1.871，見表3。

表3 影響高齡中晚期NSCLC 生存時(shí)間的多因素分析

2.4 三組NSCLC 患者的生存曲線分析三組NSCLC患者中位生存期、1年生存率、隨訪結(jié)束時(shí)各組總生存率見表4。生存曲線顯示三組曲線明顯分開，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），見圖1。

圖1 三組高齡中晚期NSCLC 患者的生存曲線

表4 三組患者的中位生存時(shí)間、1年生存率和總生存率比較

3 討論

CTCs 是實(shí)體腫瘤播散在血液中的“種子”，在血行播散、移行及定植過程中，其生物學(xué)特性受多種因子調(diào)節(jié)，包括許多信號(hào)分子（如細(xì)胞因子和趨化因子等），受調(diào)節(jié)的CTCs 表型發(fā)生變化，進(jìn)而引起新的轉(zhuǎn)移性病變，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[4]。外周血CTCs 水平在一定程度上反映了患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷情況及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。近年來，多種惡性腫瘤的預(yù)后研究均提示CTCs 水平與腫瘤的預(yù)后具有相關(guān)性[5]。2004年Cristofanilli 等[6]首次報(bào)道了外周血中的CTCs 水平是預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌無進(jìn)展生存期和總生存期的有效生物標(biāo)記。有研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC 術(shù)后患者的外周血中出現(xiàn)成簇的CTCs 提示預(yù)后較差[7]。

本研究對(duì)象為保守治療的高齡老年中晚期NSCLC 患者，目前，文獻(xiàn)對(duì)這類人群的預(yù)后研究較少，也沒有合適的生物標(biāo)記物來預(yù)測生存期。CTCs由于其侵入性小，易于獲得，并且具有較好的可重復(fù)性，對(duì)老年肺癌患者來說是一種極具實(shí)用性和前景的方法學(xué)，但目前在高齡NSCLC 患者中CTCs 的研究數(shù)據(jù)較少。本研究分析了52 例高齡中晚期NSCLC 患者外周血的基線CTCs 水平，將其分為陰性組、低負(fù)荷組及高負(fù)荷組，分析臨床資料與外周血CTCs 水平對(duì)這部分人群中位生存期的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果顯示在對(duì)高齡中晚期NSCLC 患者的臨床資料單因素分析中，年齡≥80 歲、TNM 分期較高、血清CA125 水平≥35U/ml 以及CTCs 負(fù)荷較高提示預(yù)后不良，再進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示外周血CTCs 水平仍是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。高負(fù)荷組患者的中位生存期僅為3 個(gè)月，1年生存率為0，而CTCs 陰性組中位生存期可達(dá)10 個(gè)月，1年生存率可達(dá)45.0%。

本研究分析提示CTCs 負(fù)荷較高的NSCLC 患者的臨床分期更高，腺癌更多見。盡管目前外周血CTCs 水平對(duì)NSCLC 的分期指導(dǎo)意義尚無定論，但既往的諸多研究中提示肺癌臨床分期越高，CTCs陽性率往往也越高。Chen 等[8]分別檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者外周血CTCs 水平，其陽性率分別為0、12.5%、20.0%、30.9%，結(jié)果顯示外周血CTCs水平與NSCLC 的臨床分期呈正相關(guān)。這提示外周血CTCs 水平可能作為肺癌臨床分期的潛在生物標(biāo)記。關(guān)于外周血CTCs 水平與肺癌的組織病理分型的相關(guān)性研究也尚無定論，Man 等[9]發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者的外周血CTCs 陽性檢出率為74.0%，高于非腺癌NSCLC 患者（48.0%），提示CTCs 在肺腺癌患者的隨訪及預(yù)后監(jiān)測中可能更有意義。但黃祥奇等[10]發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者外周血CTCs 陽性率與腫瘤的組織病理分型無明顯相關(guān)性。因此，外周血CTCs 與NSLCLC 的組織病理分型相關(guān)性還需要依賴CTCs 檢測手段的進(jìn)步及CTCs 詳細(xì)表型的檢測來進(jìn)一步研究確定。

本研究在高齡NSCLC 中CTCs 預(yù)后分析的研究結(jié)果與其他年齡組NSCLC 的CTCs 研究結(jié)果相似，Lindsay 等[11]對(duì)125 例NSCLC 患者（平均年齡61 歲）CTCs 計(jì)數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，與CTCs 計(jì)數(shù)<5 個(gè)的NSCLC 患者相比，CTCs 計(jì)數(shù)≥5 個(gè)的患者表現(xiàn)出較差的預(yù)后，總生存時(shí)間更短，中位生存期為197d。有報(bào)道應(yīng)用CellSearch 和CEACAM5 mRNA分析方法研究未化療ⅢB 和Ⅳ期NSCLC 患者（平均年齡67 歲）的CTCs 計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，外周血中攜帶≥5 個(gè)CTCs 的患者復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[12]。杜靜怡等[13]也發(fā)現(xiàn)外周血基線CTCs 計(jì)數(shù)<5 個(gè)的晚期肺鱗癌患者比基線CTCs 計(jì)數(shù)≥5 個(gè)的患者無進(jìn)展生存期更長，基線CTCs 計(jì)數(shù)對(duì)晚期肺鱗癌患者的預(yù)后具有預(yù)測價(jià)值。此外，外周血CTCs 水平對(duì)NSCLC 患者的治療效果也有一定的預(yù)測意義，胡亞鋒等[14]發(fā)現(xiàn)CTCs 水平在中晚期NSCLC 患者化療聯(lián)合分子靶向治療過程中具有療效評(píng)價(jià)價(jià)值。李曉華等[15]研究發(fā)現(xiàn)外周血CTCs 高陽性表達(dá)是老年NSCLC 患者化療無效的獨(dú)立影響因素之一?？傊?，外周血CTCs 的研究對(duì)于NSCLC 患者的生存預(yù)測研究具有重要意義。

續(xù)表2

本研究結(jié)果提示在保守治療的高齡中晚期NSCLC 患者中，外周血中CTCs 的水平是其預(yù)后的獨(dú)立影響因素，CTCs 高負(fù)荷患者生存期較短，外周血CTCs 水平可作為高齡中晚期NSCLC 患者的預(yù)后生物標(biāo)記物。

本研究也存在一定局限性：樣本量較小，代表性不強(qiáng)，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制未對(duì)CTCs 的表型進(jìn)行進(jìn)一步分析。近年來，NSCLC 的CTCs 相關(guān)研究逐漸深入，可鑒定CTCs 中EGFR 或ALK 基因突變，隨訪新的EGFR 突變（包括T790 突變等），以及鑒定除了基因突變以外的遺傳改變，包括NSCLC中的ALK/ROS1 重排，和PD-1 或PD-L1 等免疫治療位點(diǎn)[16]。這些CTCs 的研究新領(lǐng)域?qū)SCLC 的治療及藥物耐藥性分析都有重要意義，這也將是CTCs 研究未來的發(fā)展方向。