卵巢癌與宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)變異及意義

郝佳星 彭真 鄒淑花

[摘要]?目的?探討卵巢癌及宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)變異的意義及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法?從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫得到宮頸癌（275例）和卵巢癌（201例）病人PIK3CA基因的mRNA表達(dá)矩陣、拷貝數(shù)變異情況及相關(guān)基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果?卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)變異比例均較高。臨床病理特征分析顯示，卵巢癌病人PIK3CA基因擴(kuò)增變異的病人預(yù)后較差，而宮頸癌病人PIK3CA基因擴(kuò)增變異病人高級別病理分級占比較低。生存分析表明，PIK3CA基因擴(kuò)增變異對卵巢癌及宮頸癌病人無病生存期和總生存期無顯著影響。KEGG分析表明，宮頸癌及卵巢癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人所激活的信號通路類似，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增會激活PI3K-AKT信號通路進(jìn)而促進(jìn)卵巢及宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。GO分析表明，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增對細(xì)胞內(nèi)的生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組分均有顯著影響。結(jié)論?PIK3CA基因拷貝數(shù)異常在卵巢癌及宮頸癌中極為常見，可能成為臨床治療的分子指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]?卵巢腫瘤;宮頸腫瘤;磷酸肌醇3-激酶類;基因劑量

[中圖分類號]?R737.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號]?2096-5532（2021）04-0493-05

拷貝數(shù)變異是后基因組時代被逐漸認(rèn)識到的腫瘤性疾病特征性改變。人類基因組有眾多頻率、強(qiáng)度不等的重復(fù)序列，而拷貝數(shù)變異被定義為涉及范圍從1 kb到數(shù)Mb不等的基因片段的刪除、插入、復(fù)制及多位點變異的改變類型[1-2]。目前研究認(rèn)為，拷貝數(shù)變異不僅是個體遺傳差異的基礎(chǔ)，也在體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移定植中發(fā)揮著重要作用，拷貝數(shù)變異相關(guān)指標(biāo)或可成為理想的腫瘤診斷標(biāo)志物。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/AKT是經(jīng)典的腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，PI3K/AKT通路的高活化與多種腫瘤凋亡抑制、侵襲轉(zhuǎn)移及促血管生成密切相關(guān)，而PI3K是該通路的關(guān)鍵分子[3]。在哺乳動物中編碼催化PI3K亞基的8種基因中，只有編碼普遍表達(dá)的p110α催化亞基的PIK3CA常有高突變率[4]。突變的PIK3CA持續(xù)活化，上調(diào)PI3K/AKT通路水平進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生。既往已有較多關(guān)于結(jié)直腸癌、乳癌中PIK3CA突變及拷貝數(shù)變異的研究報道，而PIK3CA在卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤中研究并不多見[3]。本文借助癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫，將臨床樣本數(shù)據(jù)與RNA-Seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，探討PIK3CA基因拷貝數(shù)異常在卵巢癌、宮頸癌中的表型及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以期為卵巢癌及宮頸癌惡性進(jìn)展機(jī)制研究及診斷提供思路[5]。

1?材料和方法

1.1?研究對象

相關(guān)數(shù)據(jù)自TCGA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中下載獲取，檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)宮頸癌及卵巢癌的 Illumina HiSeq_RNA-Seq測序數(shù)據(jù)并進(jìn)行打包整理。

1.2?數(shù)據(jù)分析

1.2.1?納入研究樣本數(shù)量?在TCGA可視化數(shù)據(jù)庫cBioPortal（https：//www.cbioportal.org）中選擇Ovary/Fallopain Tube→Ovarain Epithelial Tu-mor→Ovarain Serous Adenocarcinoma（TCGA，?Pan Cancer Atlas），共獲得了201例符合要求的研究樣本;選擇Cervix→Cervical Squamous Cell Carcinoma（TCGA，?Pan Cancer Atlas），共獲得275例符合要求的研究樣本。

1.2.2?病人總體樣本及PIK3CA基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增分析?分別選擇Mutations;Putative copy-number alteration from GISTIC;mRNA Expression Zscores，RSEM（Batch normalized from Illumina HiSeq_RNASeqV2）。選擇完畢后提取mRNA表達(dá)矩陣，運用R語言的R Bioconductor/DESeq2、ggplot等軟件包進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)行可視化作圖。

1.2.3?病理特征分析?在所獲取樣本中，二次檢索宮頸癌及卵巢癌病人中PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的臨床信息，分別收集具有完整病史及臨床病理診斷結(jié)果等臨床信息的卵巢癌及宮頸癌病人。

1.2.4?卵巢癌、宮頸癌腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路生物信息學(xué)發(fā)掘?根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣的矩陣分組，比較卵巢癌、宮頸癌PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的基因差異，差異基因表達(dá)分析的數(shù)據(jù)要求先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以避免誤差。所獲得的數(shù)據(jù)使用軟件edgeR（3.12.1）R Bioconductor包進(jìn)行解析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用功能分析（Gene Ontology，?GO）方法及通路分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，?KEGG）并富集分析差異基因功能。

1.2.5?生存分析?采用Kaplan-Meier及Cox模型對所獲得的樣本進(jìn)行生存分析，對結(jié)果進(jìn)行Log-rank檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?兩組病人PIK3CA基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增情況

在納入的卵巢癌201例研究樣本中，對17個基因的擴(kuò)增情況進(jìn)行分析，擴(kuò)增前5位的基因分別為PIK3CA（55%，110/201）、PRKCI（48%，96/201）、MYC（41%，82/201）、MECOM（35%，70/201）和KRAS（33%，66/201），其病理分型均為卵巢上皮性腫瘤。在納入的宮頸癌275例研究樣本中，對17個基因的擴(kuò)增情況進(jìn)行分析，擴(kuò)增前5位的基因分別為PIK3C（62%，170/275）、PRKCI（36%，99/275）、EIF5A2（28%，77/275）、MECOM（19%，52/275）和AKT2（19%，52/275）;病理分型中宮頸鱗狀細(xì)胞癌占84.5%，宮頸腺癌占8.8%，宮頸黏液腺癌占5.7%，子宮內(nèi)膜樣癌占1.0%。病人總體樣本17個基因拷貝數(shù)擴(kuò)增分布見圖1、2。

2.2?卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的臨床及病理特征

在納入的201例卵巢癌研究樣本中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增110例;在納入的275例宮頸癌研究樣本中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增170例。對PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的臨床及病理特征分析顯示，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增在卵巢癌及宮頸癌41～60歲年齡病人占比最高，均超過50%。在卵巢癌病人中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人腫瘤各病理分級比例接近，其中病理分級為3級者占比均超過80%，而且PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的病死率（50.91%）明顯高于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者（39.56%）。而在宮頸癌病人中，PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人高級別病理分級占比（32.94%）明顯低于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者（53.33%），而PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的病死率（20.49%）低于不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者（24.76%）。PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增影響卵巢癌病人病死率，而在宮頸癌病人中對腫瘤的病理分級具有顯著影響。見表1。

2.3?PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與預(yù)后相關(guān)性

生存分析顯示，卵巢癌病人不攜帶PIK3CA基因拷貝數(shù)變異病人的無病生存期和總生存期長于PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增者，但差異無顯著性（P>0.05）;宮頸癌病人不攜帶PIK3CA基因拷貝數(shù)變異者與PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增者的總生存期與無病生存期無明顯差異（P>0.05）。見圖3、4。

2.4?宮頸癌及卵巢癌病人中的生物信息學(xué)分析

KEGG分析表明，宮頸癌及卵巢癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異病人所激活的信號通路類似，PIK3CA基因所參與的較為有關(guān)聯(lián)性的信號通路見圖5。對PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶該基因拷貝數(shù)變異者的差異基因進(jìn)行比較，結(jié)果顯示PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增可能會引起一些基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的變化，從而激活下游一些信號通路。PIK3CA的激活可參與調(diào)節(jié)第二信使PIP3的傳導(dǎo)以及PI3K磷酸化，激活PI3K-AKT信號通路。KEGG富集分析表明，在宮頸癌及卵巢癌病人中，PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失調(diào)、RNA轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對差異基因數(shù)目大于100的通路進(jìn)行GO分析顯示，細(xì)胞內(nèi)的三大板塊生物進(jìn)程、分子功能、細(xì)胞組分很多方面均受到顯著影響。見圖6、7。

3?討?論

隨著腫瘤生物學(xué)研究的深入，人們對腫瘤的認(rèn)知深入到了分子水平。目前就腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及進(jìn)展機(jī)制，最廣泛被接受的是“突變致癌”學(xué)說[6-7]?；蚩截悢?shù)變異是一種常見的基因多位點突變形式，其可影響腫瘤的生物學(xué)表型及異質(zhì)性，驅(qū)動腫瘤復(fù)雜性生長。卵巢癌、宮頸癌均是極為常見的婦科惡性腫瘤[8-10]。開發(fā)出理想的實驗室診斷標(biāo)志物，對卵巢癌和宮頸癌早期診斷、明確腫瘤分期進(jìn)而制定正確治療方案及改善病人預(yù)后均有重大意義[11-13]。

腫瘤細(xì)胞中存在著多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常表達(dá)，PI3K/AKT為其中常見的通路之一。PI3K是影響該通路表達(dá)水平的決定性分子[14]，PI3K的持續(xù)活化常預(yù)示著腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。PI3K為異源二聚分子，其基本結(jié)構(gòu)由一個起催化作用的PI3KC亞基和一個起調(diào)節(jié)作用的PI3KR亞基組成，而PI3KC亞基又由PI3KCA、PI3KCB等亞單位構(gòu)成[15-16]。其中，PI3KCA分子結(jié)構(gòu)的改變常導(dǎo)致PI3K持續(xù)激活，上調(diào)PI3K/AKT水平進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。

本文的研究結(jié)果顯示，卵巢癌以及宮頸癌病人PIK3CA基因均有顯著的擴(kuò)增，其占比分別為55%和62%;宮頸癌病人PIK3CA基因擴(kuò)增最多的為鱗狀細(xì)胞癌（84.5%），而卵巢癌病人病理類型均為卵巢漿液性上皮腫瘤，提示PIK3CA基因擴(kuò)增檢測有助于卵巢腫瘤的鑒別診斷。本文研究對TCGA數(shù)據(jù)庫及cBioPortal網(wǎng)站檢索到的卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人的臨床數(shù)據(jù)與表達(dá)矩陣分析顯示，相較于正常人群[18]，PIK3CA基因在卵巢癌及宮頸癌病人中擴(kuò)增率與拷貝數(shù)變異增加明顯;同時，卵巢癌及宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人中41～60歲所占比例均超過50%;卵巢癌病人中，病理分級3級比例最高，而宮頸癌病人PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人病理分級中、高級別比例接近。從臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的觀點來看[19]，或許PIK3CA突變可作為卵巢癌病理分型的依據(jù)，但具體價值需要進(jìn)一步的臨床研究。本文結(jié)果還顯示，卵巢癌及宮頸癌PIK3CA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增病人與不攜帶PIK3CA拷貝數(shù)變異者的病死率不同，可能與本文樣本量不夠大有關(guān)，結(jié)論有待進(jìn)一步驗證。本文生存分析顯示，卵巢癌病人中不攜帶PIK3CA拷貝數(shù)變異的病人總生存期與無瘤生存期可能更長，PIK3CA拷貝數(shù)變異可能預(yù)示不良結(jié)局;對宮頸癌而言，并無證據(jù)證實PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增和病人不良結(jié)局有關(guān)。

本文KEGG與GO分析結(jié)果顯示，PI3K-AKT信號通路在正常的生理狀況下能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，PIK3CA擴(kuò)增或突變會引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控失活，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[20]。PIK3CA的激活可參與調(diào)節(jié)第二信使PIP3的傳導(dǎo)以及PI3K磷酸化，激活PI3K-AKT信號通路。其中PTEN磷酸酶活性增加可以被氧化應(yīng)激反應(yīng)激活，而AKT磷酸化的變化會引起其下游蛋白的變化，包括下游凋亡、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等相關(guān)基因蛋白的表達(dá)變化。在卵巢癌病人中，PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增除了影響上述信號通路外，還影響內(nèi)分泌抵抗信號通路。這預(yù)示著PIK3CA拷貝數(shù)擴(kuò)增對卵巢癌病人的影響作用更加廣泛，生物功能更為多樣。

有富集分析結(jié)果顯示，PIK3CA擴(kuò)增和多種細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變相關(guān)，主要影響細(xì)胞生長、分化和維持、凋亡以及信號傳導(dǎo)等過程以及基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置[20]，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核或蛋白酶體等也受到顯著影響，如包括細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞的蛋白質(zhì)定位等。此外，轉(zhuǎn)錄組測序研究可以幫助我們找到更加復(fù)雜詳細(xì)的基因蛋白互作網(wǎng)路，了解下游基因蛋白的類型與功能。PIK3CA基因作為一種重要的癌基因，對其進(jìn)行深入研究將為闡述腫瘤的分子發(fā)生機(jī)制、早期診斷、病理監(jiān)測、腫瘤生物學(xué)行為判斷、預(yù)后評估提供豐富的臨床資料。

綜上所述，PIK3CA基因在卵巢癌及宮頸癌中具有特征性的拷貝數(shù)改變，PIK3CA基因突變與卵巢癌、宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化及進(jìn)展密切相關(guān)。對卵巢癌、宮頸癌拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)進(jìn)行深入探索及綜合分析，可為婦科惡性腫瘤標(biāo)志物開發(fā)、分子病理分型及制定個體化治療策略提供思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]KINROSS K M，?MONTGOMERY K G，?KLEINSCHMIDT M，?et al. An activating Pik3ca mutation coupled with Pten loss is sufficient to initiate ovarian tumorigenesis in mice[J].?The Journal of Clinical Investigation，?2012，122（2）：553-557.

[2]SHI X L，?QU M Y，?JIN X，?et al. Relationship between TSHR，?BRAF and PIK3CA gene copy number variations and thyroid nodules[J].?Endocrine，?2021（prepublish）.

[3]DAI J F，?WANG L，?LI L，?et al. Interplay of microRNAs to genetic，?epigenetic，?copy number variations of cervical cancer related genes[J].?Journal of Reproductive Immunology，?2020，142：103184.

[4]BOCHTLER T，?REILING A，?ENDRIS V，?et al. Integrated clinicomolecular characterization identifies RAS activation and CDKN2A deletion as independent adverse prognostic factors in cancer of unknown primary[J].?International Journal of Can-cer，?2020，146（11）：3053-3064.

[5]RODRIGUES C，?JOY L R，?SACHITHANANDAN S P，?et al. Notch signalling in cervical cancer[J].?Experimental Cell Research，?2019，385（2）：111682.

[6]張釧，郝勝菊，王惠玲. 基因組拷貝數(shù)變異與婦科惡性腫瘤的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].?中國婦幼保健，?2019，34（10）：2411-2414.

[7]JI X，?CHEN F，?ZHOU Y F，?et al. Copy number variation profile in noninvasive prenatal testing （NIPT） can identify co-existing maternal malignancies： case reports and a literature review[J].?Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology，?2018，57（6）：871-877.

[8]李佳佳，陳默，堯良清. 基于循環(huán)腫瘤DNA的染色體不穩(wěn)定性檢測在卵巢癌中的研究進(jìn)展[J].?中國腫瘤，?2018，27（7）：521-524.

[9]WANG L M，?SHEN H，?ZHU D，?et al. Increased high mobility group A 2 expression promotes transition of cervical intraepithelial neoplasm into cervical cancer[J].?Oncotarget，?2018，9（8）：7891-7901.

[10]YAN D，?YI S，?CHIU W C，?et al. Integrated analysis of chromosome copy number variation and gene expression in cervical carcinoma[J].?Oncotarget，?2017，8（65）：108912-108922.

[11]李蕾，沈鏗. PIK3CA基因在漿液性卵巢癌中的拷貝數(shù)擴(kuò)增分析及其機(jī)制探討[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，?2017，26（7）：481-484.

[12]CHEN L，?SUN F H，?YANG X D，?et al. Correlation between RNA-Seq and microarrays results using TCGA data[J].?Gene，?2017，628：200-204.

[13]康雅芳，孫蓬明. 拷貝數(shù)變異在婦科惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J].?國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，?2016，43（5）：493-496.

[14]OKKENHAUG K，?GRAUPERA M，?VANHAESEBROECK B. Targeting PI3K in cancer： impact on tumor cells，?their protective stroma，?angiogenesis，?and immunotherapy[J].?Cancer Discovery，?2016，6（10）：1090-1105.

[15]ZHAO W H，?HAO M，?CHENG X T，?et al. C-myc gene copy number variation in cervical exfoliated cells detected on fluorescence in situ hybridization for cervical cancer screening[J].?Gynecologic and Obstetric Investigation，?2016，81（5）：416-423.

[16]LI X C，?LIU C L，?HUANG T，?et al. The occurrence of gene-tic alterations during the progression of breast carcinoma[J].?BioMed Research International，?2016，2016：5237827.

[17]VANHAESEBROECK B，?WHITEHEAD M A，?PIEIRO R. Molecules in medicine mini-review： isoforms of PI3K in biology and disease[J].?Journal of Molecular Medicine，?2016，94（1）：5-11.

[18]BELLMUNT J，?WERNER L，?LEOW J J，?et al. Somatic copy number abnormalities and mutations in PI3K/AKT/mTOR pathway have prognostic significance for overall survival in platinum treated locally advanced or metastatic urothelial tumors[J].?PLoS One，?2015，10（6）：e0124711.

[19]SUGA Y，?SUGAI T，?UESUGI N，?et al. Molecular analysis of isolated tumor glands from endometrial endometrioid adenocarcinomas[J].?Pathology International，?2015，65（5）：240-249.

[20]DATTA S R，?DUDEK H，?TAO X，?et al. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery[J].?Cell，?1997，91（2）：231-241.

（本文編輯?黃建鄉(xiāng)）